跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2008年11月1日；121（第21部分）：3636-48。
doi:10.1242/jcs.028654。

过表达的亲环素B抑制内质网应激后与ROS和Ca2+稳态相关的细胞凋亡

金万金 1, Tae Gyu Choi先生, 闫丁, Yeonghwan Kim先生, 权秀哈, Kyung Ho Lee（李庆浩）, Insug Kang公司, Joohun Ha公司, 兰德尔·考夫曼, 李金华, Wonchae Choe公司, 宋秀金
附属公司

过表达的亲环素B抑制内质网应激后与ROS和Ca2+稳态相关的细胞凋亡

金万金等。 细胞科学杂志. .

摘要

内质网中错误折叠蛋白的长时间积累导致内质网应激介导的细胞凋亡。亲环素是一种蛋白质伴侣，通过其肽基-丙基顺反异构酶（PPIase）活性加快蛋白质折叠速度。在本研究中，我们证明了内质网应激通过一种新的内质网胁迫反应元件激活了内质网膜亲环素B（CypB）基因的表达。野生型CypB的过度表达减弱了内质网应激诱导的细胞死亡，而异构酶活性缺陷突变体CypB/R62A的过度表达不仅增加了内质网膜和活性氧代的Ca（2+）泄漏，而且降低了线粒体膜电位，导致细胞在暴露于内质网胁迫诱导剂后死亡。siRNA介导的CypB表达抑制使细胞更容易受到内质网应激的影响。最后，CypB与内质网应激相关伴侣Bip和Grp94相互作用。综上所述，我们得出结论，CypB通过其PPLase活性在保护细胞抵抗内质网应激方面发挥着关键作用。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
嗜环蛋白B在内质网应激下转录上调。在增殖条件（PM）下用1µM Tg和10µg/ml Tm处理H9C2细胞48小时或在分化条件（DM）下处理24小时。对照组（con）为未经处理的细胞。（A） 用抗Bip、Grp94和PDI的ER应激标记抗体进行Western blot分析。CypB蛋白水平通过密度测定法进行定量。肌动蛋白被用作负荷控制。CypB每个频带下的数字代表至少三个不同的实验，并表示为平均值±s.d*P（P）PM中与未处理细胞相比<0.05；#P（P）与DM中未经处理的细胞相比，<0.05。（B）ER应激诱导的细胞死亡的显微图。（C） 细胞凋亡标记物抗体的Western blot：caspase 3（裂解形式）、Bax（线粒体）、procaspase 12和细胞色素C（细胞溶质）。当暴露于Tg或Tm时，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的裂解，蛋白酶12的还原，细胞色素c（c）观察释放和Bax移位。β-微管蛋白和HSP60分别用作细胞溶质和线粒体部分的负荷控制。纤溶酶12每一条带下的数字代表至少三个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）PM中与未处理细胞相比<0.05；#P（P）与DM中未经处理的细胞相比，<0.05。（D）通过Hoechst 33342染色测定凋亡诱导的染色质凝集。黄色箭头表示细胞凋亡诱导的染色质浓缩和断裂。在条形图中，数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）PM状态下与未处理细胞相比<0.05；#P（P）糖尿病状态下与未处理细胞相比<0.05。（E，F）CypB转录物的半定量RT-PCR分析。GAPDH mRNA扩增用作RT-PCR的对照。未经处理的细胞中CypB的转录水平作为参考。CypB每个频带下的数字代表至少三个不同的实验，并表示为平均值±s.d*P（P）PM中与未处理细胞相比<0.05#P（P）<0.05，与DM（E）中未处理的细胞相比。放线菌素D（AD）用于抑制mRNA合成*P（P）<0.05放线菌素D处理细胞与未处理细胞（F）。
图2
图2
亲环素B的启动子分析（A）使用Genomatix MatInspector程序对CypB启动子进行序列分析。CypB启动子的两个假定ERSE元件下划线。（B） CypB启动子荧光素酶报告分析。细胞在增殖条件下与1µM Tg或10µg/ml Tm孵育24小时。对照组为未经Tg或Tm处理的细胞。数据表示为五个独立实验的平均值±标准差。§P（P）<0.05与未经处理的pGL3碱性*P（P）与未经治疗的pCypB/400相比，<0.05；#P（P）与未经处理的pCypB/400相比，<0.05。（C） ERSE共识样序列的突变分析。使用包含ERSE突变启动子的基于pCypB/400的荧光素酶报告子构建物进行荧光素素酶分析。1，pGL3基本向量；2，pCypB/400；3、CCAAg突变体构建；4、aaccT突变体构建；5、CtTGG突变体构建；6，aGTGG突变体构建；7，pCypB/400包含ERSE共识序列。数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg治疗的pCypB/400相比<0.05；#P（P）与Tm治疗的pCypB/400相比，<0.05。（D） 通过ATF6或XBP1激活CypB启动子。用pCypB/400和以下结构之一进行荧光素酶分析：pcDNA、非活性ATF6、活性ATF5、未分裂XBP1、拼接XBP1或ATF6-siRNA。数据表示为从五个独立实验获得的平均值±s.d*P（P）与非活性ATF6转染相比，<0.05；#P（P）<0.05与未切割XBP1转染相比**P（P）与活性ATF6转染相比，<0.05。pcDNA作为阴性对照。所有荧光素酶数据均以相对于pCypB/400（B–d）基础活性的平均值±标准差显示。（E） CypB-ERSE基序的EMSA和超移位EMSA。将H9C2细胞的核提取物暴露于Tm 24小时或不暴露，在预孵育后用CypB-ERSE探针或突变探针（CGTtt）孵育，不含抗体或ATF6特异性抗血清。（F） 使用ATF6、XBP1或NF-Y抗体以及暴露于Tg或Tm 24小时或未暴露的H9C2细胞提取物进行ChIP分析。输入，样品代表总输入染色质的1:100稀释放大。IgG：免疫前血清。（G） 使用核提取物用抗ATF6、NF-Y或层粘连蛋白B的抗体进行蛋白质印迹。当暴露于Tg和Tm时，活性ATF6增加，而NF-Y保持不变。拉明B被用作核提取物的负荷控制。
图3
图3
亲环素B的过度表达可减轻内质网应激诱导的细胞死亡。（A） 通过western blotting分析所示转染体中CypB/wt或CypB/R62A的表达水平。对每个病例中的三个不同克隆进行分析，以排除克隆特异性的可能性。CypB被标记为myc。检测Bip和Grp94等ER伴侣蛋白作为参考，以监测CypB过度表达对其他ER伴侣蛋白的影响。肌动蛋白被用作加载控制。（B） 过度表达CypB的定位。在增殖状态下用Tg或Tm处理24小时后，通过显微镜检查GFP-CypB/wt或GFP-CypB/R62A在细胞中的定位。ER跟踪器用于识别ER。上部面板仅显示GFP的定位。中间面板显示GFP-CypB/wt的位置，而下部面板显示GFP-CypB/R62A的位置。ER跟踪器，蓝色；GFP，绿色。棒材，20µm。（C） MTT法测定增殖（PM）或分化（DM）条件下CypB/wt过度表达对内质网应激诱导的细胞死亡的抑制作用。注意，CypB/R62A过度表达进一步降低了细胞活力。数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA转染细胞相比，<0.05；#P（P）在PM和DM中分别与Tm处理的pcDNA转染细胞相比<0.05。（D） 凋亡标记抗体的Western blot：caspase 3（裂解形式），细胞色素c（c）（细胞溶质）、蛋白酶12和Bax（线粒体）。每个频带下的数字代表至少五个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA相比<0.05。（E） CypB/wt和CypB/R62A转染剂中ER驻留蛋白诱导的变化。用western blot分析细胞总提取物中的Bip、Grp94和PDI。每个频带下的数字代表至少五个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA相比<0.05。（F） CypB的防御作用不仅限于细胞类型。Chang和DU145细胞未感染腺病毒、Ad-GFP、Ad-CypB/wt或Ad-CypB/R62A。western blotting检测CypB的表达水平。通过GFP阳性监测其转导频率（约60%）。每个频带下的数字代表至少五个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）与未感染Chang和DU145细胞相比，分别<0.05。采用MTT法测定ER应激后各感染者的存活率。绿色荧光蛋白腺病毒；Ad-CypB/wt，CypB腺病毒；Ad-CypB/R62A、CypB/R62 A腺病毒。数据表示从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的非感染细胞相比，<0.05#P（P）与Tm治疗的未感染Chang和DU145细胞相比，<0.05。
图4
图4
过度表达的亲环素B抑制钙2+因内质网应激而从内质网中释放。胞浆钙的相对变化2+所示转染剂中的水平(n个=20）显示在左侧面板中，并在右侧面板中绘制。（A） 绿色代表细胞内钙2+。红色箭头（左侧面板）和虚线（右侧面板）。（B） 每个转染体用4 mM EGTA处理以减少细胞外背景钙2+在用1µM Tg处理之前。在A和B中，红色箭头（左图）和虚线（右图）表示Tg处理点。在B中，蓝色箭头（左侧面板）和虚线（右侧面板）表示EGTA治疗点。
图5
图5
嗜环蛋白B过度表达抑制ROS生成、线粒体膜损伤和染色体DNA断裂，以应对内质网应激。（A） 活性氧测量及其定量分析。虚线表示细胞中ROS的基本水平。数值为从五个独立实验中获得的平均值±标准差。（B） 基质金属蛋白酶测定及其定量分析。箭头表示线粒体受损的细胞。M1和M2分别是线粒体受损和未受损的细胞。（C） MTT法测定细胞活力。Con，未经处理；Tg，1µM Tg处理；Tg+过氧化氢酶，在Tg处理前用2000 U/ml过氧化氢酶预处理。数据是从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA相比<0.05；#P（P）与Tg治疗的CypB/R62A相比，<0.05。（D） TUNEL分析及其定量。顶部面板中的绿色箭头表示TUNEL阳性细胞。数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA相比<0.05；#P（P）与CypB/R62A的Tg治疗相比，<0.05。
图6
图6
亲环素B的siRNA敲除增强内质网应激诱导的细胞死亡。（A） 通过western blotting测定CypB-siRNA的敲除效率。检测Grp94、Bip和PDI等ER伴侣蛋白，作为监测CypB-siRNA对其他ER伴侣蛋白影响的参考。（B） MTT检测。基于con-siRNA转染的细胞活力，显示了每个细胞系的相对细胞活力。数据是从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的con-siRNA相比<0.05；#P（P）与经Tm处理的con-siRNA相比，<0.05。（C）用凋亡标记抗体进行免疫印迹：caspase 3（裂解形式）和Bax。在con-siRNA和CypB-siRNA转染Tg治疗24小时后进行TUNEL分析。绿色箭头表示TUNEL阳性细胞。每个频带下的数字代表至少五个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）与Tg处理的con-siRNA转染相比，<0.05。（D） CypB的防御作用部分依赖于半胱天冬酶。在Tg治疗之前，用50µM z-VAD-fmk培养PcDNA-、CypB/wt-和CypB-siRNA-转染细胞。用MTT法测定活细胞的百分比。数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与经Tm处理的pcDNA转染剂相比，<0.05；#P（P）与经Tm处理的CypB-siRNA转染剂相比，<0.05。
图7
图7
亲环素B与Bip和Grp94相互作用。（A） GST下拉分析。使用细菌表达的重组GST-CypB/wt和GST-CypB/R62A融合蛋白以及经或不经Tg和Tm处理的H2C2细胞提取物进行GST下拉分析。使用Bip、Grp94、CypB或GST抗体进行蛋白质印迹。单独使用GST作为阴性对照。（B） CypB与Bip和Grp94的共免疫沉淀。用非免疫血清（non-IS）或抗CypB抗体（CypB-Ab）进行免疫沉淀。（C） 酵母双杂交结合分析。pGBKT7、pGADT7、pGBKT 7/CypB/wt、pGBK T7/CypB/R62A、pGADTC 7/Grp78和pGADT7/Grp94用于酵母与AH109的双杂交分析。在左侧面板中，CypB/wt与Bip或Grp94交互。在右侧面板中，CypB/R62A还与Bip或Grp94交互。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Andreeva L、Heads R、Green CJ。亲环素及其在应激反应中的可能作用。《国际病理学杂志》。1999;80:305–315.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Baines CP、Kaiser RA、Purcell NH、Blair NS、Osinska H、Hambleton MA、Brunskill EW、Sayen MR、Gottlieb RA、Dorn GW等。亲环素D的缺失揭示了线粒体通透性转变在细胞死亡中的关键作用。自然。2005;434:658–662.-公共医学
    1. Benali-Furet NL、Chami M、Houel L、De Giorgi F、Vernejoul F、Lagorce D、Buscail L、Bartenschlager R、Ichas F、Rizzuto R等。丙型肝炎病毒核心通过诱导内质网应激和内质网钙耗竭触发肝细胞凋亡。致癌物。2005;24:4921–4933.-公共医学
    1. Bourdoncle A、Labesse G、Margueron R、Castet A、Cavailles V、Royer CA。核受体辅激活剂PGC-1alpha与雌激素受体的相互作用模式不同于SRC-1。分子生物学杂志。2005;347:921–934.-公共医学
    1. Castilho RF，Ward MW，Nicholls DG。培养小脑颗粒细胞中的氧化应激、线粒体功能和急性谷氨酸兴奋毒性。神经化学杂志。1999;72:1394–1401.-公共医学

出版物类型