Enhanced protein expression in the baculovirus/insect cell system using engineered SUMO fusions

doi:10.1016/j.pep.2008.07.010

.2008年11月；62(1):21-8.

doi:10.1016/j.pep.2008.07.010。 Epub 2008年8月5日。

利用工程SUMO融合物增强杆状病毒/昆虫细胞系统中的蛋白质表达

李柳¹, 约书亚·斯普里耶, Tauseef R Butt公司, 詹姆斯·斯特里克勒

附属公司

PMID： 18713650
预防性维修识别码：项目经理2585507
内政部： 10.1016/j.pep.2008.07.010

利用工程SUMO融合物增强杆状病毒/昆虫细胞系统中的蛋白质表达

李柳等。蛋白表达纯化器. 2008年11月.

.2008年11月；62(1):21-8.

doi:10.1016/j.pep.2008.07.010。 Epub 2008年8月5日。

作者

李柳¹, 约书亚·斯普里耶, Tauseef R Butt公司, 詹姆斯·斯特里克勒

附属

¹Lifesensors，Inc.，研发部，美国宾夕法尼亚州马尔文，19355。

PMID： 18713650
预防性维修识别码：项目经理2585507
内政部： 2016年10月10日/2010年8月7日

摘要

昆虫细胞中重组蛋白的表达因蛋白质而异。融合标签不仅是检测和纯化的工具，而且可以增强表达和/或溶解度，这将大大促进结构/功能研究和治疗性蛋白质的生产。我们已经证明，SUMO（小泛素相关修饰物）与几种测试蛋白的融合可以提高大肠杆菌中的表达水平。然而，在真核表达系统中，SUMO标签可以被内源性去氨酰化酶裂解。为了将SUMO-fusion技术应用于这些系统，我们开发了一种替代的SUMO-derived标签，命名为SUMOstar，该标签不经天然SUMO蛋白酶处理。在本研究中，我们用几种蛋白质在杆状病毒/昆虫细胞系统中测试SUMOstar标签，即小鼠UBP43、人类类胰蛋白酶βII、USP4、USP15和GFP。我们的结果表明，与天然或His（6）标记蛋白相比，与SUMOstar融合后的蛋白表达水平提高了至少4倍。我们分离出活性SUMOstar标记的UBP43、USP4、USP15和GFP。在用SUMOstar特异性蛋白酶切割后，色氨酸酶是活跃的。SUMOstar系统将对难以表达的蛋白质，尤其是那些需要天然N末端残基才能发挥功能的蛋白质产生重大影响。

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数字

图1
GFP在Sf9细胞中的表达分析。Sf 9电池（2×10⁶)MOI为0.05时感染了含有各种GFP结构的杆状病毒。在感染后120小时收集细胞并进行裂解。（A）等量的总蛋白、可溶性蛋白用SDS-PAGE分析，分离蛋白用考马斯蓝染色。（B）表达gp67His的细胞裂解物₆SUMOstar和gp67His6-GFP构建物也使用抗-His的蛋白质印迹分析₆抗体作为第一抗体。使用富士成像仪拍摄染色凝胶或蛋白质斑点的图像。使用富士图像分析软件估计每个蛋白质的相对含量。标记蛋白的分子量（单位：kDa）显示在每张图片的旁边。*不适用。*虽然SUMO的计算分子量为11.5kDa，但在SDS-PAGE上其迁移的表观分子量约为20kDa。本土GFP和His的地位₆指示SUMOstar GFP。Gp67=Gp67信号序列，His6=六边形标签，SUMO=SUMO融合伙伴；SUMO*=SUMOstar融合伙伴。

图2
UBP43在Sf9细胞中的表达分析。单元格（10⁴)在24孔板中，感染了携带His的杆状病毒₆-UBP43（H）、SUMOstar-UBP43（S*）或他的₆SUMOstar-UBP43（HS*）在不同的MOI下，如图所示。按照材料和方法中的描述，在感染后140小时收集细胞并进行SDS-PAGE分析。每条车道上装载了同等数量的电池。电泳后，分离的蛋白质用考马斯蓝染色。按照图1图例所述进行图像采集和分析。

图3
Sf9细胞向培养基中分泌色氨酸酶βII和GFP的分析。（A）单元格（10⁴)在6孔板中，以0.1、1或5的MOI感染了携带gp67-Tryptase（G）、gp67SUMO-Tryptpase（GS）或gp67SUMOstar-Tryptrase（GS*）的杆状病毒。仅在MOI为1时分析与GFP的相应融合。在感染后72小时收集每个井的条件培养基，并通过300×g离心10分钟进行澄清。澄清的样品使用0.5 ml Microcon浓缩器（MWCO 10 kDa，Millipore，Billerica，MA）在14000×g下浓缩40分钟。在每个通道中装载等量的浓缩培养基。（B）用SDS-PAGE对表达G-色氨酸酶或GS*-类胰蛋白酶的细胞的等分样品进行裂解和分析，以确定融合蛋白是否保留在细胞内。电泳后，分离的蛋白质用考马斯蓝染色。按照图1图例所述进行图像采集和分析。

图4
从Sf9条件培养基中分离分泌的SUMOstar-Tryptase。秘密gp67His₆按照“材料和方法”一节中的描述，通过与Ni-NTA混合，以分批模式从100 mL条件培养基中捕获SUMOstar-淀粉酶。（A）对起始条件培养基（L）、未结合物质（FT）、洗脱液（W）和浓缩洗脱液馏分（E）的等分样品进行SDS-PAGE分析。（B）使用Chromozym TH作为类胰蛋白酶底物，通过与SUMOstar蛋白酶孵育，检测混合和浓缩洗脱液部分的类胰蛋白酶活性，如材料和方法一节所述。（●）与SUMOstar蛋白酶、肝素和SUMOstar-加密酶的完全反应混合物。()与肝素和SUMOstar-加密酶反应混合物，但不含SUMOstar蛋白酶。()反应混合物减去SUMOstar-加密酶和SUMOstar蛋白酶。在另一个实验中，发现SUMOstar蛋白酶对类胰蛋白酶底物没有活性（数据未显示）

公式图像 — 图4
从Sf9条件培养基中分离分泌的SUMOstar-Tryptase。秘密gp67His₆按照“材料和方法”一节中的描述，通过与Ni-NTA混合，以分批模式从100 mL条件培养基中捕获SUMOstar-淀粉酶。（A）对起始条件培养基（L）、未结合物质（FT）、洗脱液（W）和浓缩洗脱液馏分（E）的等分样品进行SDS-PAGE分析。（B）使用Chromozym TH作为类胰蛋白酶底物，通过与SUMOstar蛋白酶孵育，检测混合和浓缩洗脱液部分的类胰蛋白酶活性，如材料和方法一节所述。（●）与SUMOstar蛋白酶、肝素和SUMOstar-加密酶的完全反应混合物。()与肝素和SUMOstar-加密酶反应混合物，但不含SUMOstar蛋白酶。()反应混合物减去SUMOstar-加密酶和SUMOstar蛋白酶。在另一个实验中，发现SUMOstar蛋白酶对类胰蛋白酶底物没有活性（数据未显示）

图5
细胞内USP4和USP15的分离和活性测定。他的隔离₆根据材料和方法中的描述，从Sf9细胞裂解物中提取SUMOstar酶。（A）对USP4分离样品的等分样品进行SDS-PAGE分析，L=澄清细胞裂解物，FT=Ni-NTA柱中的未结合部分，W=柱中的低咪唑洗脱物，E=混合洗脱和浓缩洗脱部分。他的预期位置₆显示SUMOstar-USP4。（B）从USP15。按照（A）标记样品。他的预期位置₆显示SUMOstar-USP15。每种纯化酶处理Ub-PLA2以释放活性PLA2的能力如材料和方法所述。（C） 5种Ub-PLA2处理活动()或10()USP4浓缩池的μL。（D） Ub-PLA2处理活性为5()或10()USP15浓缩池的μL。对于这两者，该线表示数据与方程式1的拟合。由于PLA2基板耗尽，计算中不包括方框内的点。

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[10] Li SJ，Hochstrasser M.酵母细胞周期进展所需的一种新蛋白酶。自然。1999;398:246–51.-公共医学

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