Murine cirrhosis induces hepatocyte epithelial mesenchymal transition and alterations in survival signaling pathways

doi:10.1002/hep.22397

比较研究

.2008年9月；48(3):909-19.

doi:10.1002/hep.22397。

小鼠肝硬化诱导肝细胞-上皮-间充质转化及生存信号通路的改变

塔卡西·尼塔¹, Jae-Sung Kim（金在成）, 达格马拉·莫胡奇, 凯文·贝尔斯

附属公司

PMID： 18712785
预防性维修识别码：项目经理4118693
内政部： 10.1002/hep.22397

比较研究

小鼠肝硬化诱导肝细胞-上皮-间充质转化及生存信号通路的改变

塔卡西·尼塔等。肝病学. 2008年9月.

.2008年9月；48(3):909-19.

doi:10.1002/hep.22397。

作者

塔卡西·尼塔¹, Jae-Sung Kim（金在成）, 达格马拉·莫胡奇, 凯文·贝尔斯

附属

¹美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学普通和胃肠（GI）外科外科。

PMID： 18712785
预防性维修识别码：项目经理4118693
内政部： 10.1002/hep.22397

摘要

与正常肝脏中的肝细胞相比，慢性损伤肝脏中的肝细胞具有改变的生长反应。转化生长因子β（TGF-β）在肝硬化肝中上调，与正常肝细胞不同，肝硬化肝细胞暴露于该细胞因子后，表现出凋亡减少。在胎儿肝细胞中，TGF-β还诱导上皮-间充质转化（EMT）和细胞生存途径中的信号改变。这里，通过每周两次四氯化碳给药8周来诱导小鼠慢性肝损伤。对正常肝细胞（NLDH）和肝硬化肝细胞（CLDH）进行EMT检测，并对小母鼠抗十肽麻痹同系物（Smad）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K/Akt）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路进行研究。肝硬化的免疫荧光成像显示波形蛋白表达增加，免疫印迹分析证实了这一点。在体外，CLDH在与EMT一致的细胞延伸内表现出波形蛋白和1型胶原表达增加。TGF-β治疗增强了CLDH的EMT反应。相反，未经治疗的NLDH没有表现出EMT特征，但对TGF-β有反应，波形蛋白表达和EMT特征增加。与NLDH相比，CLDH对PI3K/Akt抑制的反应是降低了基础和胰岛素刺激的p-Akt表达，并减少了细胞凋亡。在NLDH和CLDH中，波形蛋白的表达依赖于PI3K/Akt活性。CLDH显示基础p-细胞外信号调节激酶表达增加，其不依赖于Smad和PI3K/Akt信号传导。MAPK通路的抑制导致CLDH凋亡显著增加。

结论：CLDH增加了波形蛋白和1型胶原的表达，形态学特征与EMT一致。此外，与NLDH相比，CLDH的细胞信号表型从MAPK非依赖性途径转变为MAPK依赖性细胞生存途径。这些发现可能对肝硬化肝细胞癌的化学预防具有临床意义。

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数字

图1
肝硬化中的波形蛋白。（A）通过免疫荧光染色观察正常和肝硬化小鼠肝脏中的波形蛋白。每个面板代表一个单独的实验。注意肝硬化肝细胞中波形蛋白的特征性纤维染色。相反，在对照肝的肝细胞中几乎没有染色。（B）对照组小鼠（n=5）和肝硬化小鼠（n=5）肝裂解物的Western blot分析。所有裂解物均来自五个单独的实验，在肝硬化肝脏中显示波形蛋白过度表达。

图2
原代培养肝细胞中的波形蛋白。（A）肝细胞形态变化的延时成像。在有无TGF的情况下，注意CLDH呈成纤维细胞样外观β（B）含有或不含TGF的原代培养肝细胞裂解物的Western blot分析β在TGF前后，CLDH的波形蛋白表达高于NLDHβ治疗。（C）波形蛋白的免疫荧光显微镜。肝细胞与波形蛋白（绿色）、F-actin（红色）和Hoechst 33342（蓝色）共染色，收集共聚焦图像。TGF公司β治疗诱导了NLDH中波形蛋白和EMT的形态学表达，而未治疗的NLDH没有表现出间充质特征。然而，即使是未经治疗的CLDH也表现出EMT的特征。转化生长因子增强了这些特征β.

图3
依赖PI3K/Akt途径。（A） NLDH和CLDH在不同胰岛素浓度的培养基中培养16-18小时。在NLDH中，与CLDH相比，p-Akt表达增加。即使在没有胰岛素的情况下，NLDH的p-Akt表达也高于CLDH。（B）与NLDH相比，向CLDH中添加100 nM胰岛素并未显示p-Akt的持续表达。（C） TGF后24小时检测形态学凋亡β在PI3K/Akt通路抑制存在下的刺激。使用Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）评估细胞死亡。（D）细胞凋亡的量化。凋亡表示为凋亡细胞占总细胞的百分比。TGF显示NLDH的凋亡死亡显著增加β与CLDH相比(*P（P）*粗体>0.001）。注意，使用LY294002和TGF治疗的CLDHβ与LY294002或TGF相比，细胞凋亡进一步发展β独自一人。

图4
抑制PI3K/Akt和MEK/ERK通路对TGF的影响βSmad信号通路。（A） PI3K抑制剂LY294002在治疗的1小时内以剂量依赖的方式降低了正常和肝硬化肝细胞中的p-Akt。MEK1/2抑制剂U0126以剂量依赖性方式降低NLDH和CLDH的p-ERK1/2。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号没有相互依赖性。（B） Smad信号对TGF响应的时间过程β.TGF诱导Smad2/3磷酸化β在NLDH中持续24小时。相反，CLDH在2小时后显示p-Smad2下降。通过LY294002预处理，TGF后p-Smad2显著降低βNLDH和CLDH的治疗。然而，Smad2/3信号转导的初始反应不受LY294002的影响。（C） TGF后6小时P-Smad2/3下降β在NLDH和CLDH中以剂量依赖的方式进行1次治疗。（D）在使用TGF治疗之前，NLDH和CLDH被表达Smad7（Ad.Smad7）或控制蛋白荧光素酶（Ad.Luc）的腺病毒感染24小时，感染倍数（MOI）为10βSmad7过表达抑制了NLDH和CLDH中p-Smad2和p-Smad3的表达。此外，Smad7治疗后，NLDH和CLDH中p-Akt的表达均显著降低，而CLDH则略有降低。

图5
抑制PI3K/Akt和ERK1/2通路对TGF后EMT的影响β刺激。（A） NLDH和CLDH用LY294002（25μM）或U0126（25μM）并用TGF刺激βCLDH的波形蛋白基础表达高于NLDH，刺激24小时后进一步增加。与符合EMT反应的CLDH相比，NLDH表现出较高的闭塞素和E-cadherin表达以及较低的波形蛋白表达。（B） LY294002（LY）预处理抑制了NLDH和CLDH中波形蛋白的表达。然而，U0126（U）对波形蛋白的表达没有抑制作用。

图6
原代培养肝细胞中的1型胶原。（A） 1型胶原的Western blot分析显示CLDH中胶原的表达增加。（B）在含有或不含TGF的两种细胞培养24小时后β共聚焦显微镜采集胶原（绿色）和Hoechst 33342（蓝色）的免疫荧光图像。（C）使用或不使用TGF孵育24小时后β免疫荧光染色检测肝细胞标志物白蛋白的表达。注意，尽管形态代表EMT，CLDH还是用白蛋白阳性染色。

图7
MEK/ERK抑制对转化生长因子的影响β-诱导细胞凋亡。（A） TGF对MAPK通路的抑制作用β治疗导致CLDH细胞显著死亡。（B）各组细胞凋亡的定量分析。CLDH通过MAPK抑制和TGF显著增加细胞凋亡β处理(*P（P）*< 0.001).

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