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.2008年8月；29(8):1483-92.
doi:10.1093/carcin/bgn045。 Epub 2008年2月28日。

骨源性SDF-1通过CXCR4、ERK和NF-kappaB途径刺激IL-6释放，并促进人类口腔癌细胞的破骨细胞生成

赤新汤 1, 靖远庄, 冯逸卿, Ming-Chei Maa公司, 魏宗德, 洪建辉
附属公司

骨源性SDF-1通过CXCR4、ERK和NF-kappaB途径刺激IL-6释放，并促进人类口腔癌细胞的破骨细胞生成

志新堂等。 致癌作用. 2008年8月.

摘要

口腔鳞状细胞癌（SCC）具有侵袭骨骼的显著倾向。趋化因子基质细胞衍生因子-1（SDF-1）由成骨细胞组成性分泌，在造血细胞归巢到骨髓中发挥关键作用。白细胞介素（IL）-6在破骨细胞生成中起重要作用。在此，我们发现SDF-1α增加了培养的人SCC细胞中IL-6的分泌，如逆转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验所示。SDF-1α也增加了SCC细胞中趋化因子受体4（CXCR4）的表面表达。CXCR4中和抗体、CXCR4特异性抑制剂（AMD3100）或针对CXCR4的小干扰RNA抑制SDF-1α诱导的IL-6生成增加。SDF-1α对IL-6的转录调控是通过细胞外信号调节激酶（ERKs）磷酸化和核因子-κB（NF-kappaB）组分p65和p50的激活介导的。SDF-1α增强了p65和p50与IL-6启动子上NF-kappaB元件的结合。此外，IL-6抗体拮抗SCC条件培养基增加的破骨细胞生成。这些结果表明，成骨细胞分泌的SDF-1α可以通过激活CXCR4、ERK和NF-kappaB通路，诱导人SCC细胞释放IL-6，从而促进破骨细胞的形成。

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数字

图1。
图1。
SDF-1α诱导人SCC细胞产生IL-6。(一)用SDF-1α（100 ng/ml）孵育人SCC细胞（HSC3、SCC4、SCC9）；分别采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）或western blot分析检测IL-6的mRNA或蛋白水平。将SCC细胞与不同浓度的SDF-1α孵育24 h(B类)或使用SDF-1α（100 ng/ml）持续4、8、12、18或24小时(C类). 收集培养基以测量IL-6。表达了一式三份的四个独立实验的结果*P（P）与基础水平相比<0.05。(D类)用多粘菌素B（poly B，1μM）预处理SCC4细胞30分钟，然后用脂多糖（LPS）（1μM）或SDF-1α（100 ng/ml）刺激24小时。收集培养基以测量IL-6。表达了一式三份的四个独立实验的结果*P（P）与基础水平相比<0.05。#P（P）与LPS或SDF-1α治疗组相比，<0.05。(E类)将SCC4细胞与SDF-1α（100 ng/ml）孵育指定的时间间隔，然后收集细胞裂解物，并分别通过RT-PCR或western blot分析测定CXCR4的mRNA或蛋白水平。(F类)将SCC4细胞与SDF-1α（100 ng/ml）孵育指定的时间间隔，并使用流式细胞术测定CXCR4的细胞表面表达。(G公司)将人全长CXCR4或载体转染SCC4细胞48 h；用western blot分析检测CXCR4蛋白水平。(H（H）)将人全长CXCR4或载体转染SCC4细胞48 h，然后与SDF-1α孵育24 h，收集培养液检测IL-6。表达了一式三份的四个独立实验的结果。
图2。
图2。
SDF-1α/CXCR4介导SDF-1β诱导的IL-6表达。(一)用AMD3100（200500 ng/ml）、CXCR4中性化抗体（12G5；10μg/ml）和小鼠单克隆免疫球蛋白同型对照物（同型抗体；10μg/ml）预处理SCC4细胞30分钟。收集培养基以测定IL-6。(B类)将突变型siCXCR4或siCXCR4转染SCC4细胞24小时；分别用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）或western blot分析测定CXCR4的mRNA和蛋白水平。(C类和D类)用siCXCR4或siCXCR4-siRNA的突变形式转染SCC4细胞24小时，然后用SDF-1α（100 ng/ml）或成骨细胞条件培养基（OBCM；75%）刺激。分别采用酶联免疫吸附法或RT-PCR和蛋白质印迹法测定IL-6的培养基或mRNA和蛋白质水平。(E类)将SDF-1α或对照siRNA转染成骨细胞（MG-63）24 h。转染SDF-1 siRNA后，通过RT-PCR和western blot分析测定SDF-1 a的mRNA或蛋白水平受到抑制(F类)将SDF-1α或对照siRNA转染成骨细胞24 h，收集培养液作为条件培养基，应用于SCC4细胞，分别用RT-PCR或western blot分析检测IL-6的mRNA或蛋白水平。
图3。
图3。
ERK参与SDF-1α增强IL-6表达。将SCC4细胞与SDF-1α（100 ng/ml）孵育指定的时间间隔，并通过western blot分析测定p-ERK、p-p38、p-JNK或p-Akt的表达(一). 用PD98059（10μM）、SB203580（10μM）、SP600125（10μS）和Akt抑制剂（10μC）预处理细胞30分钟(B类)或转染ERK、p38、JNK和Akt显性阴性（DN）突变体(C类)持续24小时，然后用SDF-1α（100 ng/ml）刺激24小时。收集培养基以测量IL-6。结果表示为平均值±SE*P（P）与车辆相比<0.05。#P（P）与SDF-1α治疗组相比，<0.05。
图4。
图4。
NF-κB参与SDF-1α增强IL-6的生成。(一)在与SDF-1α（100 ng/ml）孵育24 h之前，用NF-κB ODN、AP-1 ODN或打乱ODN转染SCC4细胞。收集培养基以测定IL-6。(B类)用PDTC（60μM）预处理细胞30分钟，L（左）-收集培养基以测定IL-6。表示了一式三份进行的四个独立实验的结果*P（P）与对照组相比<0.05。#P（P）与SDF-1α治疗组相比，<0.05。(C类)用SDF-1α（100 ng/ml）处理细胞指定的时间间隔，用p65或p50特异性抗体免疫印迹法分别测定细胞溶质和细胞核p65或p50的水平。(D类和E类)用SDF-1α（100 ng/ml）处理细胞达到指定的时间间隔，或用AMD3100（500 ng/ml。用抗p65或抗p50抗体免疫沉淀染色质。对沉淀的染色质的百分之一进行分析，以验证负载是否相等（输入）。(F类)用κB-荧光素酶表达载体转染细胞，然后用AMD3100（500 ng/ml）、PD98059（10μM）、SB203580（10μM）、SP600125（10μL）和Akt抑制剂（10μG）预处理30 min，然后用SDF-1α（100 ng/ml）孵育24 h。结果代表了至少三个独立实验*P（P）与对照组相比<0.05。#P（P）与SDF-1α治疗组相比，<0.05。
图5。
图5。
SDF-1α诱导IKKα/β活化、IκBα磷酸化和p65 Ser276鳞状细胞癌细胞中的磷酸化。SCC4细胞与SDF-1α（100 ng/ml）孵育指定的时间间隔；然后用对IKKα/β磷酸特异性抗体对细胞裂解物进行免疫印迹(一)，磷-IκBα(B类)和p65在Ser处磷酸化276(C类)抗体。用IKKα、IKKβ突变体或载体转染细胞24小时，然后用SDF-1α刺激24小时。收集培养基以测定IL-6(D类). 结果代表了至少三个独立实验*P（P）与对照组相比<0.05。#P（P）与SDF-1α治疗组相比，<0.05。用AMD3100（500 ng/ml）或PD98059（10μM）预处理细胞，然后用SDF-1α（100 ng/ml276然后用western blot测定(E类).
图6。
图6。
来自SCC4细胞的条件培养基支持破骨细胞分化。将来自SCC4细胞的条件培养基添加到PBMC培养中。每周更换一半培养基三次，并在第10天终止培养。板被染上TRAP(一，上面板）。另一方面，PBMC在破骨细胞活性测定底物板上培养，10天后去除细胞（A，下面板）。箭头显示破骨细胞吸收坑。(B类)将对照培养基、对照培养基加巨噬细胞集落刺激因子、SCC4调节培养基或A549调节培养基加入PBMC培养中。每周更换一半培养基三次，第10天终止培养。板被染上TRAP。注意，SCC4-和A549条件培养基（但非对照培养基）刺激TRAP阳性多核细胞。(C类)抗IL-6抗体（200μg/ml）而非同种型IgG抑制SCC4条件培养基诱导的破骨细胞生成。(D类)在SCC4条件培养基中加入IL-6抗体（200μg/ml）、RANKL-Fc（200 ng/ml）、IL-6抗体加RANKL-Fc、转化生长因子-β抗体（200微克/毫升）、IL-1抗体（200微米/毫升）；IL-6抗体、RANKL-Fc、IL-6抗体加RANKL-Fc而非TGF-β或IL-1抗体阻断SCC4条件培养基诱导的破骨细胞生成*P（P）与对照组相比<0.05。#P（P）与IgG治疗组相比，<0.05。(E类)成骨细胞衍生的SDF-1α诱导人SCC细胞产生IL-6和促进破骨细胞增殖的信号通路示意图。成骨细胞释放SDF-1α，然后激活CXCR4、ERK和IKKα/β，从而激活IL-6启动子上的NF-κB，启动IL-6 mRNA和蛋白的释放，促进破骨细胞的形成。
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