Regulation of Smad-mediated gene transcription by RGS3

doi:10.1124/mol.108.044990

.2008年5月；73(5):1356-61.

doi:10.1124/mol.108.044990。 Epub 2008年2月20日。

RGS3对Smad介导的基因转录的调控

道格拉斯·M·尤¹, 南·塞塔科恩, 塞巴斯蒂安·陶林, 史蒂文·克雷格尔, 内森·桑德博, 布兰卡·卡莫雷蒂·梅卡多, 安妮·斯珀林, 尼克莱·O·都林

附属公司

PMID： 18287247
预防性维修识别码：项目经理3329871
内政部： 10.1124/月108.044990

RGS3对Smad介导的基因转录的调控

道格拉斯·M·尤等。分子药理学. 2008年5月.

.2008年5月；73(5):1356-61.

doi:10.1124/mol.108.044990。 Epub 2008年2月20日。

作者

道格拉斯·M·尤¹, 南·塞塔科恩, 塞巴斯蒂安·陶林, 史蒂文·克雷格尔, 内森·桑德博, 布兰卡·卡莫雷蒂·梅卡多, 安妮·斯珀林, 尼克莱·O·都林

附属

¹美国伊利诺伊州芝加哥市60637，MC 6076，马里兰州南大街5841号，芝加哥大学医学部，肺和危重病护理科。

PMID： 18287247
预防性维修识别码：项目经理3329871
内政部： 10.1124摩尔.108.044990

摘要

G蛋白信号转导（RGS）蛋白的调节因子通过同源RGS结构域的存在结合异源三聚体G蛋白的α亚单位并加速其GTPase活性而结合成一个家族。作为该家族的一员，RGS3通过结合相应的Galpha亚基来调节G（q）和G（i）蛋白介导的信号传导。在这里，我们表明RGS3与新的伙伴Smad2、Smad3和Smad4相互作用，这些转录因子通过转化生长因子-β（TGF-β）受体信号被激活。这种相互作用由RGS结构域外的RGS3区域和Smad的Mad同源2结构域介导。RGS3的过度表达导致Smad介导的基因转录受到抑制。RGS3不影响TGF-β诱导的Smad磷酸化，但它阻止Smad3与Smad4的异聚合，而Smad4是Smads转录活性所必需的。这转化为RGS3对TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化的功能抑制。总之，本研究确定了RGS3通过与Smad相互作用和干扰Smad异构化在TGF-β信号调节中的一种新的非经典作用。

PubMed免责声明

数字

图1
RGS3和Smad蛋白之间的相互作用。A、用cDNA转染CHO细胞以获得所需的标记或Myc标记蛋白，然后用Flag抗体进行免疫沉淀（IP），用Myc或Flag免疫印迹（WB），如图所示。B、对EL4细胞（每种情况5000万个细胞）进行裂解，并用“正常”IgG或RGS3抗体进行免疫沉淀。免疫复合物或原始裂解物用RGS3、Smad3或Smad4抗体进行免疫印迹分析，如图所示。

图2
MH2结构域介导Smad3与RGS3的相互作用。用Myc-RGS3和标记的全长Smad3（FL）、Smad3 MH1+L的1-225片段、Smad3L+MH2的133-426片段或Smad3的226-426片段的cDNA转染细胞。细胞裂解物用Flag抗体免疫沉淀（IP），然后用Myc或Flag免疫印迹（WB）。

图3
映射RGS3的Smad-binding区域。用Myc-Smad3和标记的全长RGS3（FL）、RGS3的240-519片段或RGS3 379-519片段的cDNA转染细胞。细胞裂解物用Flag抗体免疫沉淀（IP），然后用Myc或Flag免疫印迹（WB）。

图4
RGS3抑制Smad介导的基因转录。A、 Smad3过度表达对RGS3对内皮素信号的调节没有影响。用Elk1-荧光素酶报告质粒TK转染CHO细胞-*肾形葡萄球菌*控制质粒，A型ET1受体cDNA（参见*材料和方法*详细信息），并增加RGS3 cDNA的浓度（由空载体平衡），如图所示，添加或不添加50 ng Smad3 cDNA。用100 nM内皮素-1（ET1）刺激血清饥饿的细胞6 h，然后将其溶解。裂解物的萤光素酶活性标准化为*肾形葡萄球菌*活性并以平均值±S.D.B和C表示，RGS3对Smad介导的基因转录的抑制。用SBE-荧光素酶报告基因TK转染CHO细胞-*肾形葡萄球菌*控制质粒（参见*材料和方法*详细信息）和50ng RGS3或其突变体的空载体或cDNA。用2 ng/ml TGF刺激血清饥饿的细胞-β24小时后溶解。裂解物的荧光素酶活性标准化为*肾形葡萄球菌*活性，用平均值±S.D.表示。所示为至少三次独立实验的代表性结果，共三次。D、 RGS3的N460A突变体不结合G蛋白。用空载体或标记野生型（WT）RGS3或其N460A突变体的cDNA转染CHO细胞。用Flag抗体溶解细胞并免疫沉淀 $30 μ M（M） {AIF公司}_{4}^{-}$ .检测免疫复合物或总细胞裂解物的Gαi3通过Western blotting。

图5
RGS3对TGF的影响-β-诱导Smad信号。A、 RGS3过度表达不影响TGF-β-诱导Smad2磷酸化。用Flag-Smad2 cDNA和Myc-RGS3 cDNA或空载体转染CHO细胞。使用或不使用2 ng/ml TGF刺激血清饥饿的细胞-β30分钟后溶解。然后用免疫沉淀法将Flag-Smad2标志抗体和免疫复合物用所需抗体进行免疫印迹分析。B、 RGS3对Smad3-Smad4相互作用的抑制。用Flag-Smad3、Myc-Smad4、Myc-RGS3的cDNA或空载体转染CHO细胞。用2 ng/ml TGF刺激血清饥饿的细胞-β30分钟后溶解。然后用Flag抗体免疫沉淀Flag-Smad3，并用所需抗体通过Western blotting分析免疫复合物或总细胞裂解物。

图6
TGF的规定-β-诱导SM-α-RGS3表达肌动蛋白。A、用RGS3腺病毒（Ad-RGS3）或对照绿色荧光蛋白腺病毒（Ad-GFP）转导人肺成纤维细胞，然后用或不用2ng/ml转化生长因子刺激-β然后对细胞进行裂解，并用所需抗体通过Western blotting对细胞裂解产物进行分析。B、用百日咳毒素（100 ng/ml）预处理人肺纤维母细胞过夜，然后用或不用2 ng/ml TGF刺激-β48小时后，对细胞进行裂解，并用所需抗体通过Western blotting对细胞裂解产物进行分析。

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