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比较研究
.2007年10月24日；27(43):11769-75.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1938-07.2007。

LKB1通过中心体定位调节发育中新皮质的神经元迁移和分化

浅田直树 1, 卡蒙·萨纳达, 福田吉隆
附属公司
比较研究

LKB1通过中心体定位调节发育中新皮质的神经元迁移和分化

浅田直树等。 神经科学. .

摘要

大脑皮层是通过协调高度组织化的细胞过程形成的，如神经元迁移和神经元成熟。神经元的极性建立和神经元细胞骨架的极性调节对这些事件至关重要。在这里，我们发现LKB1，秀丽隐杆线虫极性蛋白Par4的最接近同源物，在发育中的新皮质中表达。在迁移的未成熟神经元中LKB1的敲低会损害神经元的迁移，导致中心体位置的改变以及中心体和细胞核之间的解耦。此外，皮质板内分化神经元中LKB1的损伤导致中心体在细胞核基底侧的错位，而不是正常的顶端定位。这伴随着轴突和树突极性的破坏，导致分化神经元的方向颠倒。此外，LKB1在体外指定了轴突和树突的身份。总之，这些观察结果表明LKB1在神经元迁移和神经元分化中起着关键作用。此外，我们认为适当的神经元迁移和分化与LKB1指导的中心体定位/运动的精确控制密切相关。

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数字

图1。
图1。
LKB1在发育中的小鼠脑中的表达。一使用抗LKB1多克隆抗体（顶部面板）和抗β-肌动蛋白单克隆抗体（mAb）（底部面板）对来自不同年龄段的新皮质裂解物（60μg蛋白质）和前脑裂解物（120μg蛋白质网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。通过用不同的LKB1抗体（抗LKB1单克隆抗体）重制印迹来确认LKB1的表达谱（中间面板）。来自转染LKB1表达质粒的HEK293T细胞的裂解物用作阳性对照（Con）。B类,现场E14片段的正反义探针杂交磅1mRNA（见补充方法，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。比例尺，100μm。C类用抗LKB1（红色）和Tuj1（绿色）抗体对DIV 3的新皮质神经元进行免疫染色。比例尺，20μm。D类用GFP质粒和LKB1 RNAi#2构建物或对照RNAi构建物（pBS-U6）转染新生皮层神经元，固定于DIV 1，并用GFP（绿色）、LKB1（红色）和Tuj1（蓝色）抗体进行免疫染色。比例尺，10μm。
图2。
图2。
敲低LKB1会损害神经元的迁移。A–CLKB1 RNAi构建物或对照RNAi构造物（pBS-U6）与GFP质粒一起电穿孔到E14胚胎中，如图所示，大脑固定在E16、E17和E18。一脑切片用抗GFP抗体（绿色）进行免疫染色。细胞核用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）染色。显示了具有代表性的图像。比例尺，100μm。B类计算E17脑切片VZ、IZ和CP中GFP标记细胞的百分比，并绘制为平均值±SEM（对照组分别为6、4和5个胚胎，RNAi#1和RNAi#2）**第页< 0.01, ***第页<0.001与双尾韦尔奇对照t吨测试。C类用抗GFP（绿色）和CS-56（红色）抗体对E17脑切片进行免疫染色。比例尺，100μm。D类将LKB1 RNAi构建物或对照RNAi构造物与编码GFP和DsRed2-CentrinII的质粒一起电穿孔到E14胚胎中。在E17脑切片中，位于上IZ的控制性RNAi导入和LKB1 RNAi引入神经元均显示出典型的迁移形态学，且具有主导过程。箭头表示由DsRed2-CentrinII标记的中心体。实线表示细胞核（蓝色，TO-PRO-3碘化物）和中心体（红色）之间的最短距离，测量并绘制为平均值±SEM(n个=23、20和28个细胞（分别用于对照、RNAi#1和RNAi#2）E类. **第页< 0.01, ***第页<0.001与双尾韦尔奇对照t吨测试。比例尺，5μm。
图3。
图3。
LKB1功能丧失会破坏神经元极性和轴突规范。LKB1 RNAi构建物或对照RNAi构造物（pBS-U6）与GFP质粒一起在DIV 2转染初级皮质神经元。在DIV 4，皮质神经元被固定。一，用抗Tau-1（红色）和MAP2（蓝色）的抗体对新皮质神经元进行免疫染色。比例尺，50μm。B类，具有多个Tau-1-阳性突起的神经元比率被量化并绘制为平均值±SEM(n个=60、54和54个细胞，分别用于对照、RNAi#1和RNAi#2）***第页<0.001与对照（χ）2测试。C–H型，总轴突数(C类)和神经突总长度(D类)对对照细胞和带有多个Tau-1-阳性轴突的RNAi导入细胞进行量化，并以平均值±SEM表示年-轴(E–H（E–H）)测量并表示为平均值±SEM。#第页>0.8（单向方差分析）*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001与双尾韦尔奇对照t吨测试(n个分别为20、14和14个对照细胞、RNAi#1和RNAi#2）。我在DIV 5处用磷酸化GSK3β（Ser-9）（红色）和Tau-1（蓝色）抗体对新皮质神经元进行免疫染色。GFP阳性神经元和GFP阴性神经元的Tau-1-阳性突起的尖端分别用箭头和箭头表示。右侧两个面板中的RNAi#2转染神经元（GFP-阳性）在任何轴突尖端都没有磷酸化GSK3β信号（箭头所示）。比例尺，20μm。
图4。
图4。
LKB1的敲除导致CP中分化神经元的方向发生逆转。一，E14胚胎电穿孔，大脑固定在P4。然后用抗GFP（绿色）和Tuj1（红色）抗体对脑切片进行免疫染色。一,b条，左侧两个面板中方框区域的高清晰度图像。RNAi导入大脑中的大多数GFP标记神经元仍位于新皮质的下层，而对照RNAi引入大脑中的少量GFP标记细胞位于类似的区域。比例尺，100μm（左侧面板）和40μm（右侧面板）。B–D类中括号所示的CP区神经元的形态一进行了详细分析。B类，白色箭头表示GFP标记的神经元具有原始树突样轴突，其顶端朝向。红色箭头表示GFP标记的神经元具有心室方向的树状突起。右侧面板，左侧面板中装箱的细胞的高倍图像。比例尺，30μm（左侧面板）和10μm（右侧面板）。C类，量化反向定向神经元的比率。数据表示为平均值±SEM(n个=来自3个胚胎的1028、750、2191个神经元，分别用于控制、RNAi#2和救援）***第页<0.001与对照（χ）2测试。D类，细胞核用TO-PRO-3碘化物（蓝色）染色。GFP标记神经元的中心体用抗中心蛋白抗体（红色）标记，并用箭头表示。左侧的小面板显示了用对照RNAi电穿孔的大脑CP中GFP标记细胞的高倍图像。中间的面板显示了用LKB1 RNAi#2电穿孔的大脑CP中GFP标记细胞的典型图像。定向正常的GFP标记细胞(一)和方向相反(b条)已装箱。右侧的小面板是正常的高倍图像(一)和倒转(b条)中间面板中的单元格。小面板中GFP标记的单元格用虚线勾勒出来。比例尺、5μm（左右面板）和10μm（中间面板）。
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