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.2007年7月11日；27(28):7365-76.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0956-07.2007。

NMDA受体在控制脊椎和突触稳定性中的独特结构和离子性作用

维罗妮卡·阿尔瓦雷斯 1, 丹尼斯·A·骑手, 贝尔纳多·萨巴蒂尼
附属公司

NMDA受体在控制脊椎和突触稳定性中的独特结构和离子性作用

维罗妮卡·阿尔瓦雷斯等。 神经科学. .

摘要

NMDA型谷氨酸受体（NMDAR）在突触传递的快速调节中起着核心作用，但其对谷氨酸能突触长期稳定的作用尚不清楚。我们发现，在大鼠器官型切片中的海马锥体神经元中，NMDARs的药理学阻断不会影响突触的形成和树突棘的生长，但会增加棘的运动性。RNA干扰受体NR1亚单位所导致的突触NMDAR的物理性丢失也会增加脊椎的运动性。此外，NMDAR的敲除（而非其药理阻断）会破坏脊椎结构的稳定性，并且随着时间的推移会导致脊椎和兴奋性突触的丢失。维持正常脊柱密度需要包含C末端C2盒的NR1亚单位的两种特定剪接亚型的共表达。因此，尽管NMDAR的离子性特性可诱导突触可塑性，但正是受体C尾的物理相互作用调节突触和脊椎的长期稳定。

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图1。
图1。
针对NR1的shRNA降低蛋白质水平和NMDAR介导的突触电流。一，转染GFP控制质粒（顶部）或GFP和shNR1共存的双基因质粒（底部）的分离锥体神经元图像。在7DIV下转染神经元，并在10d DPT时对NR1和MAP2进行免疫染色。箭头和星号分别表示转染和未转染神经元。B类对照和shNR1表达神经元NR1（顶部）和MAP2（底部）荧光免疫染色的累积分布(n个= 18–43). 数据来自三个具有类似结果的独立实验之一。NR1免疫染色的分布具有统计学差异(第页<0.01，Kormogorov–Smirnov试验）。C类，海马器官型切片的宽视野荧光图像显示GFP稀疏转染锥体神经元。显示了记录电极（rec）在金字塔层（s.pyr.）中的位置和刺激电极（stim）在辐射层（s.rad.）中的地位。D类，在−60 mV（快速向内电流）和+40 mV（慢速向外电流）的保持电位下，由表达GFP（顶部）和表达shNR1（底部）的锥体神经元（10 DPT）记录的Schaffer络脉刺激诱发的EPSC。在−60 mV电流峰值处和40 mV峰值后150 ms处测量振幅。E类，来自控制（黑色）和表达shNR1（灰色）神经元的正常突触电流显示了+40 mV时电流的时间进程和幅度差异。F类，+40和−60 mV时电流比的累积分布，R（右）+40/−6010 DPT时GFP（对照组；填充圆）和shNR1表达（开放圆）神经元。分布在统计上有所不同(第页<0.01，Kormogorov–Smirnov试验）。G公司，平均R+40/−60在NMDAR拮抗剂CPP（1μ米)在10 DPT时(n个= 10–12). *第页与对照组相比<0.05。比例尺：一，10微米；C类，100微米。
图2。
图2。
shNR1神经元树突棘运动增强。一在10 DPT时，对海马器官型切片中表达shNR1的锥体神经元的棘状树突进行时间-双光子激光扫描显微成像。切片在30°C的切片培养基中浸泡成像时间（90-120分钟）。箭头标志着一个短暂的树突突起。一些脊椎改变形状和大小（箭头），而其他脊椎保持相对恒定的长度和宽度（星号）。比例尺，2.5μm。B类、10 DPT时对照组GFP（黑色）和shNR1（灰色）神经元中持续性棘（整个成像过程中存在的棘）和短暂性树突状突起（伸展和收缩）的百分比(n个=6–7个细胞，267–293个脊椎）。对照组和shNR1神经元在每个类别中的百分比在统计上是不同的(第页< 0.01, χ2测试）。C类，对照（黑色）和shNR1（灰色）神经元中持续棘的棘长和棘宽的动力学指数(n个=6–7个细胞，214–235个脊椎）*第页< 0.01.
图3。
图3。
突触NMDAR减少的神经元中树突棘丢失。一转染GFP（顶部）或shNR1（底部）的器官型切片中的海马锥体神经元在20DPT下用2PLSM成像。B类，10 DPT（左）和20 DPT（右）的对照（上）和shNR1（下）神经元树突的高倍图像。C类，对照组和shNR1神经元脊柱密度的发育情况(n个= 10–28).D类，总结各种条件下15 DPT时的脊椎密度。尼泊尔卢比1物件表示shNR1靶区具有沉默突变的NR1-1抗性克隆；shNR1随后总结了在8DIV（而不是3DIV）转染shNR1并在10DPT下成像的神经元的数据。比例尺：一，50微米；B类，2微米*第页与对照组相比<0.05；#第页与shNR1神经元相比<0.05；ANOVA和Student–Newman–Keuls多重比较测试。
图4。
图4。
缺乏突触NMDAR的神经元中活性突触丢失。一，20 DPT时来自对照和shNR1神经元的mEPSCs的代表性记录。校准：200 ms，20 pA。B类，输入电阻汇总(R（右）在里面)和膜电容(C类米)用于20 DPT时的控制（黑色）和shNR1（灰色）神经元(n个= 21–26). *第页< 0.05.C类，20 DPT时对照（黑色）和shNR1（灰色）神经元的mEPSC和mIPSC振幅（左）和频率（右）总结(n个mEPSC和mIPSC分别为15–18和12–13）*第页< 0.05.
图5。
图5。
功能性AMPAR在缺乏NMDAR介导电流的脊髓中表达。一，图为充满Alexa Fluor-594的锥体神经元的棘状树突，显示谷氨酸去钙化位点（星号）。B类，谷氨酸2PLU在控制（左）和shNR1（右）神经元脊髓上诱发的电流，分别保持在−60 mV（内向电流）和+40 mV（外向电流）。在填充点指示的时间测量AMPAR和NMDAR介导的电流振幅。C类，在-60 mV和+40 mV电压下记录到的由谷氨酸从对照（黑色）和shNR1（灰色）神经元的单棘上不结合引起的正常化电流。D类，的累计直方图R（右）+40/−60在CPP（1μ米; 灰圈）和shNR1神经元（开圈）(n个= 12–18).E类，平均R（右）+40/−60来自对照组、对照组加CPP、shNR1神经元和与NR1-1耐药克隆（shNR1+NR1）共转染的shNR1神经细胞的单个脊髓物件)在10 DPT时(n个= 12–18). *第页与对照组相比<0.05；#第页与shNR1相比<0.05。
图6。
图6。
PSD-95簇在shNR1神经元的剩余脊髓中形成。一，器官型切片中对照（顶部）和shNR1（底部）锥体神经元的树突分支图像，显示树突形态（mRFP）和10 DPT时PSD-95–GFP的分布。B类，表达GFP（顶部）和shNR1（底部）的分离锥体神经元显示GFP荧光和内源性PSD-95在10DPT时的荧光免疫染色。C类，10 DPT时对照组（黑色）和器官型切片中shNR1（灰色）神经元PSD-95–GFP点的线密度总结(n个= 6). *第页< 0.05.D类，10 DPT时分离培养的对照（黑色）和shNR1（灰色）神经元内源性PSD-95点密度和强度的免疫染色总结(n个= 14–12). *第页< 0.05.
图7。
图7。
NMDAR的离子特性调节脊椎动力学，但不调节脊椎数量。一，对照组未经处理的GFP神经元（−AP-5；黑色）和经50μ米AP-5（+AP-5；灰色）持续8天(n个=6个细胞，257–293个脊椎）。对照组和AP-5处理的神经元的分布在统计学上是不同的(第页< 0.01, χ2测试）。B类，未经处理的对照组（黑色）和AP-5处理的（灰色）神经元中持久性棘的棘长和棘宽的动力学指数。C类，未经处理（左）和AP-5处理（右）的20 DPT切片中对照和shNR1锥体神经元的树突。用50μ米AP-5开始于10 DPT。D类未处理切片（黑色）和经AP-5处理的切片（灰色）20 DPT时对照组和shNR1锥体神经元的脊髓密度。
图8。
图8。
树枝状棘的维护需要拼接变体NR1-1和NR1-2。一，NR1亚单位的示意结构，显示C末端C2和C2′盒。B类，NR1 mRNA示意图（顶部），显示了四个外显子（N，C1，C2，C2′），这些外显子通过差异剪接产生NR1亚型。背线表示shNR1目标区域（不按比例）。NR1救援克隆（NR1）示意图物件)用于结构需求分析的数据显示在底部。蓝色区域表示突变的shNR1靶区，灰色区域表示跨膜结构域。C类，转染NR1救援剪接亚型和shNR1（黑条）的锥体神经元15DPT时的脊椎密度总结。阴影水平条显示15 DPT时对照（灰色）和shNR1（红色）神经元脊柱密度的平均±2*SEM*第页与shNR1神经元相比<0.05；#第页与对照神经元相比<0.05；ANOVA和Student–Newman–Keuls多重比较测试。
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