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.2007年8月；6(8):1299-317.
doi:10.1074/mcp。M700054-MCP200。 Epub 2007年5月9日。

小鼠光感受器感觉纤毛复合体的蛋白质组

秦柳 1, 格伦·谭, 娜塔莎·列文科娃, 李天森, 爱德华·N·普格, 约翰·J·鲁克斯, 大卫·W·斯派克, 埃里克·A·皮尔斯
附属公司

小鼠光感受器感觉纤毛复合体的蛋白质组

秦柳等。 分子细胞蛋白质组学. 2007年8月.

摘要

初级纤毛在生物学的许多方面发挥着关键作用。初级纤毛的专门版本涉及感觉的许多方面。单个感光细胞感觉纤毛（PSC）或视网膜每一个视杆细胞和视锥细胞形成的外段就是一个典型的例子。编码纤毛成分的基因突变是疾病的常见原因，包括视网膜退化。哺乳动物初级纤毛和感觉纤毛的蛋白质成分以前还没有定义。在此，我们报告了小鼠PSC复合体的详细蛋白质组学分析。PSC复合体由外段及其细胞骨架组成，包括轴丝、基底体和睫状根，纤毛根延伸到感光细胞的内段。PSC复合体蛋白质组包含1968个蛋白质，由三个或更多独特的肽表示，包括约1500个低等生物纤毛中未检测到的蛋白质。这包括105个假想蛋白质和60个由基因编码的蛋白质，这些基因在23种遗传性纤毛相关疾病的关键区间内进行定位，增加了它们作为候选基因的优先级。PSC复合体蛋白质组还包含许多以前在感光细胞中未发现的纤毛蛋白质，包括13种由含有导致纤毛疾病的突变基因产生的蛋白质和7种鞭毛内转运蛋白质。对缺乏纤毛小根的rootletin基因敲除小鼠的PSC复合体进行分析，证实1185个已鉴定的PSC复合蛋白来自外段。质谱数据以15种特征良好的外段蛋白质为基准，用于量化小鼠杆外段中每个蛋白质的拷贝数。这些结果表明，哺乳动物的纤毛比单细胞生物的纤毛复杂数倍，并为研究纤毛是如何构建和维持的以及这些过程在人类疾病中是如何被破坏的开辟了新的途径。

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数字

图1
图1。棒状感光细胞和分离用于分析的部分的图解
A类，棒状感光细胞示意图。注意，小根从基底体向下延伸至细胞体，轴丝从基底体向上延伸至外段。一个过渡区（所谓的连接纤毛）连接着内外段。B类，通过LC-MS/MS分析PSC复合物制剂。PSC复合物和PSC复合物细胞骨架数据的组合（+）被定义为PSC复合物蛋白质组。PSC复合体蛋白质组和根素-KO-PSC复合体之间的重叠（+）确定了位于PSC-OS中的蛋白质。PSC复合物和PSC-OS之间的差异（−）确定了与PSC-IS相关的蛋白质。数字在里面圆括号是检测到的蛋白质数量；见正文和图3。颜色属于标签对应于图2和图3中使用的值。
图2
图2。纯化PSC复合物和组分
A类，野生型PSC复合体示意图显示，它由外节及其细胞骨架组成，包括小根、基底体和轴丝。B–D类用差示干涉对比和荧光显微镜观察野生型PSC复合物的制备。放大倍率更高(C类和D类)可以看出，PSC复合体由在其底部具有薄延伸的外段组成。延伸部分是细胞质细胞骨架中附着在基底体上的部分，如用根素抗体染色所示(红色;B类和D类). 用Rp1抗体染色显示外节的轴丝(绿色;D类). 放大倍数较低时(B类)，很明显，该制剂由高度富集的PSC络合物组成，受其他结构的污染最小。E–H（E–H），PSC复合体细胞骨架的绘制(E类)和分离的PSC复合细胞骨架制剂，用微分干涉对比观察(G公司)和荧光显微镜(F类和H（H）)使用根素抗体(红色)和Rp1(绿色). 细胞骨架由小根、基底体和轴突组成，如图所示高度纯化。I–K型，rootletin KO PSC复合体图纸(我)和rootletin KO PSC复合制剂(J型和K（K）)用微分干涉对比和荧光显微镜观察，并用根素抗体染色(红色)和Rp1(绿色). 在这些PSC复合体中，小点在基部可见生根素染色，但没有形成的小根。颜色属于标签对应于图1和图3中使用的值。BB公司，基体；RT公司纤毛小根；TZ公司过渡带；AX公司，轴丝。酒吧= 5μ米。
图3
图3。野生型和根叶素KO-PSC复合物和PSC复合细胞骨架蛋白的蛋白质组学分析
A类，野生型PSC复合体(车道1)，PSC复合细胞骨架(车道2)和rootletin KO PSC复合物(车道3)如前所述制备蛋白质并进行电泳。指出了分子质量标记的大小。B类，野生型PSC复合体蛋白质组的维恩图，显示了PSC复体的贡献(红色)和PSC复合细胞骨架制剂(黄色的)和重叠(橙色).C类，维恩图显示野生型PSC复合体蛋白质组与根素KO PSC复合物分析中的蛋白质的比较(蓝色).D类，蛋白质组学分析总结，确定了PSC-OS和PSC-IS组。颜色匹配中的维恩图C类.细胞，细胞骨架。
图4
图4。PSC复合体蛋白质组和亚组中的功能群和蛋白质结构域
A类，来自PSC复合体蛋白质组和亚组的DAVID和EASE分析结果。注释术语来自基因本体、蛋白质信息资源和解释数据库。计数，所示注释组中蛋白质组或亚组成员的数量。这个第页值是PSC复合体蛋白质组或亚组中注释术语中相对于总注释小鼠蛋白质集的蛋白质富集的Fisher精确测试测量值。绿色阴影强调PSC复合物蛋白质组的指示亚组中的富集。B类和C类，图表显示了完整PSC复合体蛋白质组中主要富集功能群的蛋白质比例(B类)和常见纤毛蛋白质（与纤毛蛋白质组数据集共享）(C类). 数据来自A类.
图5
图5。小鼠PSC复合物中新蛋白的定位
A类–D类，新PSC复合蛋白的验证实例。用本研究中确定的假定PSC复合蛋白抗体探测成年小鼠视网膜冰冻切片(红色). 用Rp1抗体对切片进行探测，以可视化感光器轴丝(绿色). 这个左半部分的图像显示红色信号，以及右半部分显示合并的红色和绿色信号。用Hoechst染料检测细胞核(蓝色).A类，Transgelin 3在邻近轴丝的近端外节（OS）中检测到。B类，Dynamin 2抗体在内段（IS）和OS的交界处呈点状染色，与基底体一致(BB公司;箭头).C类，Macf1位于近端OS，与轴丝/Rp1信号的范围密切匹配。D类，原肌球蛋白4位于轴丝的近端(箭头)和内部段。E类–H（H）PSC-IS蛋白验证示例。用冠状病毒1b和Txndc5抗体探测小鼠视网膜冰冻切片(E类和G公司)和分离的野生型PSC复合物(F类和H（H）). 在冰冻切片的内段检测到Coronin 1b(E类)和分离的PSC复合物的细胞骨架(F类)因此，作为PSC复合结构的一部分进行了评分。在冰冻切片的内段检测到Txndc5(G公司)但不在分离的PSC复合物的细胞骨架中(H（H）)并被评为非PSC复合体的一部分。AX公司轴丝；ONL公司，外核层。酒吧= 10μ米。
图6
图6。定量分析
A类，野生型和根蛋白KO PSC复合物的S/PP，针对1130个共享蛋白彼此作图。这个红线表示两种不同制剂中蛋白质的S/PP值相等的单位斜率。这个虚线和灰色阴影分别表示单位斜率±10倍和±3倍范围内的区域。B类MS/MS光谱计数与小鼠光感受器外段15种不同蛋白质拷贝数的关系。补充表S7提供了15种标准蛋白质的详细信息。这个纵坐标每个点的光谱总数除以可观察到的胰蛋白酶肽（S/PP）的预测数量；这个横坐标值给出了独立确定的杆外段蛋白质NC。在所有情况下，蛋白质拷贝数都是相对于视紫红质测定的，视紫红质体在小鼠杆外段的拷贝数为7×107. The灰色线条表达了拷贝数和记录的光谱之间的线性关系的假设，即S/PP公司=k个×NC。通过对数/对数坐标下的最小二乘回归估计直线k个= 1.805 ×10−5.
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