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.2007年7月；81(13):7111-23.
doi:10.1128/JVI.00361-07。 Epub 2007年5月2日。

流感病毒血凝素和神经氨酸酶，而不是基质蛋白，是质粒衍生病毒样颗粒组装和出芽所必需的

本杰明·J·陈 1, 乔治·P·莱斯, 盛田英治, 罗伯特·A·兰姆
附属公司

流感病毒血凝素和神经氨酸酶，而不是基质蛋白，是质粒衍生病毒样颗粒组装和出芽所必需的

本杰明·J·陈等。 J维罗尔. 2007年7月.

摘要

对于流感病毒，我们开发了一种高效、非细胞毒性、基于质粒的类病毒颗粒（VLP）系统，以反映真实的病毒颗粒。通过对VLP蛋白组成的生化分析、电子显微镜的形态分析和VLP感染性测定对该系统进行了表征。VLP系统用于确定出芽所需的最小病毒蛋白组的身份。病毒蛋白的组合在细胞中表达，并分析释放到培养基中的颗粒的多肽组成。与之前的发现相反，基质（M1）蛋白被认为是出芽的驱动力，因为在使用痘苗病毒T7 RNA聚合酶驱动的过表达系统表达M1时，发现M1大量释放到培养基中，在我们的非细胞毒性VLP系统中，M1没有有效地释放到培养基中。此外，当用外源性神经氨酸酶（NA）处理或与病毒NA共表达时，血凝素（HA）可以独立于M1从细胞中释放。将M1并入VLP需要HA表达，尽管当从VLP中删除M1时，观察到与野生型VLP或病毒形态相似的颗粒。此外，当HA和NA细胞质尾部突变体包含在VLP中时，M1未能有效地并入VLP中，这与糖蛋白通过分选到脂筏微区和招募内部病毒核心成分来控制病毒出芽的模型一致。VLP的形成也独立于Vps4在多泡体途径中的功能，因为显性负性Vps4蛋白不能抑制流感VLP的萌发。

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数字

图1。
图1。
病毒和VLP的蛋白质表达水平和出芽效率。如材料和方法中所述，通过转染或感染293T细胞来制备VLP（A）或病毒粒子（B）。在48小时p.t.或20小时p.i.时，收集培养基和细胞。细胞裂解物（细胞，第1道）、通过30%蔗糖缓冲层（30%蔗糖，第2道）造粒的材料以及通过蔗糖密度梯度（第3道至第8道）浮选VLP或病毒粒子后收集的组分通过SDS-PAGE进行分析，然后进行免疫印迹检测病毒蛋白。NP表现为双重体，这可能反映了感染细胞中已知的NP蛋白水解裂解（68）。（C） 通过代谢标记转染或感染细胞，比较VLP和病毒的出芽效率35S-Promix并在20小时后收集培养基。使用Image Gauge软件定量释放到培养基中并通过30%蔗糖垫粒化的放射性标记M1的量。通过将30%蔗糖颗粒（P）中的M1量除以颗粒和细胞裂解物（C）中的总M1量，确定相对M1释放量。仅使用全长M1带，而不是感染细胞中的剪接形式（未发表的观察结果）进行定量。误差线表示三个实验的平均值的标准偏差。
图2。
图2。
293T细胞糖蛋白释放。如图所示，HA、NA和M2蛋白在293T细胞中以组合形式表达。培养基于48h p.t.收获，并通过30%蔗糖垫造粒，按照材料和方法中的描述制备细胞。样品通过SDS-PAGE分析，然后通过免疫印迹检测病毒蛋白。如有指示，在转染后将外源性细菌NA（exo NA）添加到替换培养基中。
图3。
图3。
糖蛋白表达驱动293T细胞M1蛋白释放。HA、NA、M1、M2、聚合酶蛋白（Pol；PB1、PB2和PA）、NP和NS2（NEP）在293T细胞中以所示的组合表达。培养基于48h p.t.收获，并通过30%蔗糖垫造粒，按照材料和方法中的描述制备细胞。样品通过SDS-PAGE分析，然后通过免疫印迹检测病毒蛋白。如有指示，在转染后将外源性细菌NA（exo NA）添加到替换培养基中。使用奥德赛红外成像系统对30%蔗糖颗粒中的M1蛋白进行定量，并将其归一化为细胞裂解液中发现的M1蛋白质量。将从表达所有VLP蛋白的细胞（泳道10）释放的M1的量设定为1.0。
图4。
图4。
vTF7-3感染/转染CV1和HeLa T4细胞表达的HA和M1蛋白的释放。根据Gómez-Puertas等人（18）的方案，HA和M1通过vTF7-3表达、T7-RNA聚合酶驱动表达在CV1（A）或HeLa T4（B，上部）细胞中表达。在60小时p.t.时，收集培养基并通过30%蔗糖垫造粒，按照材料和方法中的描述制备细胞。如有指示，在20 h p.t时将外源细菌NA（exo NA）添加到替换培养基中。HeLa T4细胞（B，下部）也转染HA、NA和M1蛋白表达质粒，并如上所述分析培养基和细胞。样品通过SDS-PAGE分析，然后通过免疫印迹检测病毒蛋白。
图5：。
图5：。
蛋白质缺失的VLP萌芽。如材料和方法所述，通过转染293T细胞制备VLP。如有指示，转染中省略了编码单个蛋白的质粒，省略了编码三种聚合酶蛋白（PB1、PB2和PA）的质粒（Pol−），或转染后将外源性细菌NA（exo NA）添加到替换培养基中。培养基于48h p.t.收获，并通过30%蔗糖垫造粒，按照材料和方法中的描述制备细胞。样品通过SDS-PAGE分析，然后通过免疫印迹检测病毒蛋白。使用奥德赛红外成像系统对30%蔗糖颗粒中的M1蛋白进行定量，并将其归一化为细胞裂解液中发现的M1蛋白质量。表达所有VLP蛋白的细胞（WT，第1通道）释放的M1量设置为1.0。误差线表示三个实验的平均值的标准偏差。
图6。
图6。
如EM所示，VLP的形态。通过感染或转染293T细胞，制备含有所有VLP蛋白（WT-VLP）或缺乏M1蛋白（M1-VLP）的病毒或VLP，如材料和方法所述。培养基在20 h p.i.或48 h p.t.时收获，并通过30%蔗糖垫造粒。将颗粒重新悬浮在NTE中并制备EM。用单克隆抗HA抗体对病毒和VLP进行免疫染色，然后用与15 nm金结合的IgG进行免疫染色并进行阴性染色。条形，100 nm。
图7。
图7。
用突变糖蛋白或VSV G蛋白释放VLP。如材料和方法所述，通过转染293T细胞制备VLP。如有说明，编码wt HA或wt NA的质粒被编码HAt−、NAt−或HA-SSS突变蛋白（A）的质粒所取代，或者省略编码HA和NA蛋白的质粒，并被编码VSV g蛋白（B）的质粒数量增加（0.5μg、1.0μg和2.0μg）所取代。培养基于48h p.t.收获，并通过30%蔗糖垫造粒，按照材料和方法中的描述制备细胞。样品通过SDS-PAGE进行解析，然后通过免疫印迹检测病毒蛋白。使用奥德赛红外成像系统对30%蔗糖颗粒中的M1蛋白进行定量，并将其归一化为细胞裂解液中发现的M1蛋白质量。表达wt VLP蛋白（wt，第6通道）的细胞释放的M1量设置为1.0。
图8。
图8。
蛋白质缺失的VLP感染。如材料和方法所述，通过转染293T细胞制备VLP。如有指示，则省略编码聚合酶蛋白（PB1、PB2和PA）、NP、NS2（NEP）或M1的质粒。含VLP的培养基于48h p.t.收获并用胰蛋白酶处理。未经胰蛋白酶处理的VLP用作阴性对照。将VLP转移到表达PB1、PB2、PA和NP的靶293T细胞。24小时后，固定靶细胞，并通过流式细胞术定量GFP平均荧光强度（MFI）。覆盖有完整VLP（WT）的靶细胞的MFI设置为100%。误差线表示三个实验的平均值的标准偏差。
图9：。
图9：。
显性负性Vps4蛋白对流感病毒VLP、HIV-1、PIV-5 VLP和VSV出芽的影响。（A） 如前所述，在Vps4A-KQ或Vps4B-KQ蛋白存在的情况下检测HIV-1出芽（17，62）。（B和C）流感VLP通过转染293T细胞制备，如材料和方法所述。如有指示，转染中包括编码Vps4A KQ（B）或Vps4B KQ（B）的质粒或增加量（0.5μg、1.0μg和2.0μg）的编码Vps4A EQ（C）的质粒。含VLP的培养基于48h p.t.收获，并通过30%的蔗糖垫造粒，按照材料和方法中的描述制备细胞。样品通过SDS-PAGE进行解析，然后通过免疫印迹检测病毒蛋白和Vps4蛋白。使用奥德赛红外成像系统对30%蔗糖颗粒中的M1蛋白进行定量，并将其归一化为细胞裂解液中发现的M1蛋白质量。将转染VLP质粒和空载体（通道5）的细胞释放的M1量设置为1.0。（D） 在编码Vps4A-EQ的质粒数量增加（0.5μg和1.0μg）的情况下进行PIV-5 VLP芽接和VSV芽接，基本上如前所述（25、55）。针对C组，对释放到培养基中并在30%蔗糖颗粒中检测到的PIV-5和VSV M蛋白的相对量进行量化。（E）根据图8图例和材料与方法分析针对C组制备的流感VLP的感染性。
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