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比较研究
.2007年4月18日；26(8):2029-40.
doi:10.1038/sj.emboj.7601659。 Epub 2007年3月22日。

RGS12作为Ras/Raf/MEK支架在神经生长因子介导的分化中的选择性作用

梅琳达·D·威拉德 1, 弗朗西斯·威拉德, 李晓燕, 史蒂文·卡佩尔, 威廉·德施奈德, 大卫·P·西德罗夫斯基
附属公司
比较研究

RGS12作为Ras/Raf/MEK支架在神经生长因子介导的分化中的选择性作用

梅琳达·D·威拉德等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

G蛋白信号（RGS）蛋白的调节器通过异源三聚体G蛋白α亚基加速GTP水解，从而抑制许多G蛋白偶联受体的信号传导。一些RGS蛋白具有多域结构，除了其GTPase加速活性外，还增加了其在细胞信号传递中的作用的复杂性。RGS12包含Ras-binding结构域的串联重复序列，但迄今为止，该蛋白在Ras介导的信号转导中的作用尚未报道。在这里，我们表明RGS12与神经生长因子（NGF）受体酪氨酸激酶TrkA、活化的H-Ras、B-Raf和MEK2相关，并促进其协调信号传导以延长ERK活化。RGS12是NGF介导的PC12细胞突起生长所必需的，但不是碱性成纤维细胞生长因子刺激的突起生长。siRNA-介导的RGS12表达下调也抑制了NGF诱导的原发性背根神经节神经元分离培养的轴突生长。这些数据表明，RGS12可能在协调促进和/或维持神经元分化所需的Ras依赖信号方面发挥关键和受体选择性的作用。

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图1
图1
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联的组分被鉴定为RGS12相互作用物。(一)RGS12架构。编号表示大鼠RGS12结构域的氨基酸边界。括号表示酵母双杂交筛选中用于对抗小鼠胚胎和大脑库的诱饵。MEK2被确定为PDZ/PTB域区域相互作用物，a-Raf被确定为中央RGS/RBD域区域的相互作用物（参见补充图S1）。(B类)HEK 293T细胞与FLAG-MEK2和空载体（“mock”）共转染，或指示HA-tagged结构域。使用抗-FLAG从产生的裂解物中免疫沉淀（‘IP’）MEK2。用抗FLAG和抗HA抗体对SDS-PAGE解析的共免疫沉淀蛋白和总裂解物进行免疫印迹（‘IB’）。(C类)将HA-A-Raf与空载体或myc-RGS12共转染COS-7细胞。(D类)HA-B-Raf与空载体myc-RGS12或分离的RGS12串联RBD（'12_RBDs'）在COS-7细胞中共同转染。在面板C和D中，抗myc用于IP RGS12。然后用抗myc和抗HA抗体免疫印迹共免疫沉淀蛋白和总裂解物。
图2
图2
RGS12及其孤立的串联RBD优先与活化的H-Ras相互作用。(A、 B类)HEK 293T细胞与myc-RGS12共转染，显示HA-Ras质粒。抗-myc用于免疫沉淀RGS12，抗HA用于检测相关Ras蛋白。(C类)野生型或活化的（G12V）HA-H-Ras与HEK 293T细胞中RGS12的空载体或myc标记的分离的串联RBD区共表达。如上所述，对裂解液进行免疫沉淀和免疫印迹。(D、 E类)在HEK 293T细胞中，活化的（G12V）HA-H-Ras（D）或HA-B-Raf（E）与空载体、野生型myc-RGS12（wt）或突变型myc-RGS12（H995L）共表达。如上所述，对裂解液进行免疫沉淀和免疫印迹。
图3
图3
RGS12协调Ras/Raf/MEK/ERK复合体并增强对ERK的信号传递(一)将含有内源性PDGFβR的CHO-K1细胞转染ERK2–GFP和空载体或增加量的HA-RGS12载体，隔夜无血清，用PDGF-BB（10 ng/ml）处理5分钟，并通过抗磷酸-ERK1/2免疫印迹裂解物测定ERK2的活化。pERK2和总ERK2-GFP水平的密度定量（底部子面板）产生标准化的pERK2信号（即PDGF-BB缺失以上的倍数激活）。误差条是三个独立实验的平均值的标准误差。(B类)在HEK 293T细胞中，将HA-标记的活化H-Ras（G12V）（左）或R-Ras（G38V）（右）与空载体myc-RGS12或myc-RGS2加FLAG-A-Raf、B-Raf-FLAG或c-Raf-1-FLAG载体共转染。用抗myc免疫沉淀物免疫印迹法检测与抗HA共沉淀的Ras蛋白。用抗myc、抗FLAG和抗HA对总裂解产物进行免疫印迹以确认表达。所示图像代表了三个实验；B-Raf或c-Raf-1共表达时，R-Ras与RGS12的相互作用较弱，且在实验之间存在差异。(C类)如图所示，用myc-RGS12、HA-B-Raf、HA-MEK2和/或HA-H-Ras G12V转染HEK 293T细胞。使用抗-HA抗体对共沉淀HA-B-Raf、HA-MEK2和HA-H-Ras GV的抗-myc免疫沉淀进行免疫印迹。用抗myc的免疫印迹免疫沉淀蛋白和抗HA的总裂解物证实表达。(D类)如上所述转染HEK 293T细胞，但在指定位置添加HA-ERK1载体。表达检测和联合免疫沉淀如上所述。为了突出显示当多个Ras/MAPK组分在C组中共同转染时观察到的复合物形成增加，我们呈现出较轻的暴露，仅显示出一条微弱的带，代表HA-MEK2与myc-RGS12共同免疫沉淀。D组表示较深的暴露，以突出HA-ERK1的共同免疫沉淀，这反过来解释了RGS12–MEK2相互作用优于C组。
图4
图4
RGS12对PC12细胞中NGF介导和MAPK依赖性突起的生长至关重要。(一)PC12裂解物仅用小珠（无抗体）或抗H-Ras、抗Rap-1、抗B-Raf或抗RGS12抗体进行免疫沉淀。使用抗RGS12检测相关内源性RGS12。(B类)用非特异性（顶部）或RGS12 siRNA（底部）转染PC12细胞24 h，并用100 ng/ml NGF处理额外48 h。按照材料和方法中的描述获得图像。(C类)转染PC12细胞，用NGF处理，并成像为B组。在材料和方法中描述的三个独立实验中，每个条件下测量>100个细胞的Neurite长度。每个条件的平均值用黑线表示。非特异性与RGS12 siRNA转染培养物的中位数轴突长度有显著差异(P（P）<0.0001; Mann-Whitney检验使用了给定的非高斯分布）。插图：用非特异性（ns）或RGS12 siRNA转染PC12细胞，并在转染后24、48和96 h进行裂解，以进行RGS12和肌动蛋白的免疫印迹。(D类)用非特异性或（i）A-Raf-、（ii）B-Raf-或（iii）MEK2-定向siRNA转染PC12细胞，并在转染后72 h裂解用于免疫印迹，以检测肌动蛋白和相关蛋白靶点的表达。(E类)用基因特异性siRNAs转染PC12细胞，如D组所示，所得轴突长度统计数据如C组所示进行量化。非特异性和A-Raf定向siRNA治疗之间的轴突长度无统计学差异（亚组（i）；P（P）>0.05，Mann-Whitney试验），但B-Raf和MEK2击倒后显著降低(P（P）子面板（ii）和（iii）均<0.0001；Mann-Whitney试验与非特异性siRNA）。(F、 G公司)通过转染活化的（G12V）H-Ras（平均值±标准偏差：42.1±2.8μm）和活化的（V600E）B-Raf（平均值？标准偏差：40.6±2.6μm）刺激的PC12神经细胞生成被RGS12敲除减弱（平均数±标准偏差为27.6±2.2μm（F）和27.3±1.8μm（G））。每次治疗都要进行100次神经突长度的独立测量。
图5
图5
RGS12耗竭后，NGF延长的ERK激活减少，表达的RGS12呈点状并与内胚体标记物共存，膜内源性RGS12的易位受NGF调节。(一)用非特异性或RGS12 siRNA转染PC12细胞并用NGF刺激。在NGF治疗后的指定时间，用抗磷酸化ERK1/2或抗ERK1/2的免疫印迹（inset）测定ERK激活（pERK）和总ERK表达。Scion Image用于pERK1/2水平的密度定量和最大信号的归一化（5分钟时的非特异性siRNA）。误差条表示三个独立实验的平均值的标准误差。(B类)在PC12细胞中，通过siRNA-介导的B-Raf和MEK2水平的下调，而不是A-Raf水平的下调也可以减少ERK的长期激活。pERK1/2水平的密度定量标准化为最大信号（120分钟时的非特异性（ns）siRNA）。(C类)用pEYFP-N1空载体、YFP-RGS12或RGS12-YFP载体转染PC12细胞24 h，并在外荧光成像前用100 ng/ml NGF处理48 h。(D、 E类)用RGS12-YFP（绿色）转染PC12细胞24小时，用100 ng/ml NGF处理48小时，固定、渗透，并在共聚焦显微镜前用早期内体标记EEA1（D，红色）或晚期内体标记LAMP1（E，红色）染色。RGS12-YFP和内体标记的染色显示为黄色。白色箭头表示RGS12-YFP与单个punta上的EEA1或LAMP1共定位。(F类)在指定的时间点用NGF刺激PC12细胞，然后按材料和方法所述将其分为膜、细胞溶质、核和细胞骨架部分。用抗RGS12或抗核膜标记物层粘连蛋白A/C或质膜标记物抗泛素抗体对SDS-PAGE分解的蛋白质进行免疫印迹。
图6
图6
RGS12形成包含TrkA的多蛋白复合物，并对TrkA信号和FGFR信号具有选择性。(一)用myc-RGS12和空载体、FLAG-TrkA或HA-FGFR1质粒共同转染HEK 293T细胞。使用抗FLAG或抗HA抗体分别免疫沉淀FLAG-TrkA或HA-FGFR1。使用抗myc抗体检测相关myc-RGS12蛋白。(B类)用YFP-RGS12和（i）pcDNA3.1空载体、（ii）FLAG-TrkA或（iii）HA-FGFR1载体共同转染HEK 293T细胞，并通过共焦显微镜成像；比例尺代表20μm。(C类)如面板B所述，转染HEK 293T细胞。转染后72小时，对细胞进行裂解和免疫印迹，以验证YFP-RGS12、FLAG-TrkA和HA-FGFR1的表达。(D类)用myc-RGS12、FLAG-TrkA、HA-B-Raf、HA-MEK2和HA-H-Ras G12V质粒转染HEK 293T细胞。用单独的珠或抗FLAG抗体免疫沉淀裂解液。使用抗-HA和抗-myc检测相关的myc-RGS12、HA-B-Raf、HA-MEK2和HA-H-Ras G12V。(E类)用非特异性或RGS12 siRNA转染PC12细胞24 h，并用100 ng/ml bFGF再处理48 h。如图4C所示，对轴突长度的差异进行量化。非特异性siRNA转染细胞的中位数轴突长度与RGS12 siRNA转导细胞的中位轴突长度无显著差异(P（P）>0.03; Mann–Whitney试验）。(F类)用bFGF刺激PC12细胞达到指定的持续时间。然后将细胞分为膜、细胞溶质、核和细胞骨架部分，如图5F所示。用抗RGS12或抗核膜标志物层粘连蛋白A/C或质膜标志物抗胰蛋白酶的抗体对SDS-PAGE分解的蛋白质进行免疫印迹。
图7
图7
RGS12对于NGF介导的原代小鼠DRG神经元的轴突生长至关重要。(一)用非特异性或小鼠RGS12定向siRNA转染N1E-115小鼠神经母细胞瘤细胞，并在横断72 h后裂解RGS12和肌动蛋白的免疫印迹。(B类)用非特异性或小鼠RGS12 siRNA（连同YFP示踪剂）转染野生型小鼠胚胎（E14）DRG神经元，用NGF（50 ng/ml）培养2天，再移植，并用NGF刺激1天。YFP阳性细胞轴突在透明照相机中进行追踪，并使用IPlab进行定量。RGS12基因敲除导致最长轴突长度显著减少(P（P）<0.0001; Mann–Whitney试验）。(C类)将Bax缺陷小鼠E14 DRG神经元转染为B组，在不含NGF的情况下培养2天，用NGF（50 ng/ml）刺激36小时。YFP阳性细胞的轴突长度如B组一样进行量化。RGS12敲除导致最长轴突长度显著减少(P（P）<0.0001; Mann–Whitney试验）。(D类)用非特异性（左）或小鼠RGS12（右）siRNA转染的代表性野生型DRG神经元的显微照片。细胞体用灰色箭头表示；比例尺代表100μm。
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