Ubiquitination of RIP1 regulates an NF-kappaB-independent cell-death switch in TNF signaling

doi:10.1016/j.cub.2007.01.027

.2007年3月6日；17(5):418-24.

doi:10.1016/j.cub.2007.01.027。 Epub 2007年2月15日。

RIP1的泛素化调节TNF信号中NF-kappaB非依赖性细胞死亡开关

玛丽·安妮·奥唐纳¹, 戴安娜·莱加达·阿迪森, 佩内洛皮·斯科恩佐斯, 文成业（Wen Chen Yeh）, 阿德里安·T·汀

附属公司

PMID： 17306544
预防性维修识别码：项目经理1868513
内政部： 2016年10月10日/j.cub.2007.01.027

RIP1的泛素化调节TNF信号中NF-kappaB非依赖性细胞死亡开关

玛丽·安妮·奥唐纳等。当前生物. 2007.

.2007年3月6日；17(5):418-24.

doi:10.1016/j.cub.2007.01.027。 Epub 2007年2月15日。

作者

玛丽·安妮·奥唐纳¹, 戴安娜·莱加达·阿迪森, 佩内洛皮·斯科恩佐斯, 文成业（Wen Chen Yeh）, 阿德里安·T·汀

附属

¹美国纽约州纽约市古斯塔夫·L·利维广场1号1630信箱西奈山医学院免疫生物学中心，邮编：10029。

PMID： 17306544
预防性维修识别码：项目经理1868513
内政部： 10.1016/j.cub.2007.01.027

摘要

TNF受体1（TNFR1）可以在同一细胞内触发相反的反应：生前反应或细胞死亡途径[1,2]。细胞生存需要NF-kappaB介导的前生存基因转录[3-9]；如果NF-kappaB信号被阻断，就会发生凋亡[5,7-9]。因此，NF-kappaB的激活在TNF信号传导期间充当细胞死亡开关。这项研究表明，该通路包括另一个独立于NF-kappaB的细胞死亡开关。我们表明，赖氨酸377上RIP1的赖氨酸63连接泛素化首先通过NF-kappaB非依赖性机制抑制TNF诱导的凋亡，然后通过NF-kappaB依赖性机制。相反，在没有泛素化的情况下，RIP1通过与CASPASE-8结合而充当促凋亡信号分子。因此，RIP1是一种双功能分子，根据其泛素化状态，它既可以生存也可以产生，这在TNF信号传导的早期起到了NF-kappaB非依赖性细胞死亡开关的作用。这些结果为关于RIP1在细胞死亡中作用的相互矛盾的报道提供了解释；此前有人建议，这一角色既是生前的，也是生产的[10-12]。因为TRAF2是RIP1的E3连接酶[13]，这些观察结果为先前描述的TRAF2的NF-kappaB非依赖性抗凋亡功能提供了解释[14-16]。

PubMed免责声明

数字

**图1。RIP1的赖氨酸377调节细胞死亡**
（A）用指定剂量的TNF刺激RIP1-WT或RIP1-K377R重组的RIP1-空细胞和RIP1-空白细胞5小时和24小时。细胞用膜联蛋白V-PE染色，流式细胞仪分析。显示了膜联蛋白V反应性细胞总数的百分比。（B）用10 ng/ml TNF刺激（A）中的三个细胞株，刺激指定的时间，并分析膜联蛋白V的水平。（C）用10 ng/ml TNF刺激RIP1-WT和RIP1-K377R细胞不同时间段（左侧面板）或指示剂量的TNF刺激24小时（右侧面板）。用CASPASE-8、裂解CASPASE-3或裂解PARP的特异性抗体对细胞裂解物进行印迹。抗PARP印迹也过度暴露，以观察更多的PARP裂解产物。此外，还使用抗微管蛋白和PLCγ进行了重新绘制，以证明等效负载。这些蛋白质印迹代表了至少三个类似的实验。

**图2。RIP1的赖氨酸377提供了早期NF-κB非依赖性和晚期NFκB依赖性抗凋亡信号**
（A）用编码GST作为阴性对照（左图）或IκBαSR（右图）的逆转录病毒转导RIP1-null、RIP1-WT或RIP1-K377R细胞。用指定剂量的TNF刺激这些细胞5小时（第一组和第二组）和24小时（第三组和第四组）。细胞凋亡通过膜联蛋白V染色和流式细胞术进行分析，如图1C所示。（B）用10 ng/ml TNF刺激（A）中的细胞株，并在指定时间分析细胞凋亡。（C）用指示剂量的TNF刺激稳定转染myc标记的IκBαSR的RIP1-WT和RIP1-K377R细胞24小时（左侧）或10 ng/ml TNF刺激不同时间段（右侧）。如图1C所示，对细胞裂解物进行印迹。抗myc印迹既可作为负荷控制，也可显示两种细胞系中IκBαSR的等效表达。这些蛋白印迹是至少三个类似实验的代表。

**图3。UBC13和TRAF2具有NF-κB非依赖性抗凋亡功能**
（A）稳定表达对照蛋白GST、UBC13DN或TRAF2DN的IKKγ/NEMO-缺陷Jurkat T细胞用指定浓度的TNF处理5和24小时。annexin V染色检测细胞凋亡。（B）用2 ng/ml的TNF对（A）中的细胞株进行指定时间的处理。如图1C所示，通过western blot分析150 ug细胞提取物。进行抗-ZAP70印迹以确认等效载荷。（C）用对照GST或TRAF2DNA编码的逆转录病毒转导RIP1-null或RIP1-WT细胞。稳定选择的细胞用指示浓度的TNF处理5或24小时，并用annexin V-PE染色。（D）在（C）中用5 ng/ml TNF刺激细胞24小时的数据绘制在条形图中，以突出RIP1的双重功能作用。

**图4。RIP1的泛素化调节与CASPASE-8的关联**
（A）用10 ng/ml TNF刺激RIP1-WT和RIP1-K377R细胞达到指定时间。用抗FLAG珠免疫沉淀标记的RIP1和相关蛋白，并用FLAG肽洗脱。免疫复合物依次用抗CASPASE-8和抗RIP1作为负荷对照进行印迹。抗CASPASE-8印迹也过度暴露，以观察p43/p41裂解形式。（B）RIP1在TNF介导的细胞凋亡中作用的模型。（一）在TNFR1信号传导的早期阶段，TRAF2介导的赖氨酸377泛素化起到阻止RIP1与CASPASE-8结合的作用。这不需要NF-κB介导的基因转录。（二）在TNFR1信号传导的晚期，赖氨酸377泛素化提供的第二个促生存信号通过上调NF-κB依赖的抗凋亡基因（如c-FLIP）而变得有效。（三）在没有K63连接的多-泛素化的情况下，RIP1通过与CASPASE-8形成复合物来启动细胞凋亡，从而成为致命分子。红色表示抗凋亡分子，绿色表示促凋亡分子。

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