Mutagenesis of the La Crosse Virus glycoprotein supports a role for Gc (1066-1087) as the fusion peptide

doi:10.1016/j.virol.2006.08.050

.2007年2月20日；358(2):273-82.

doi:10.1016/j.virol.2006.08.050。 Epub 2006年10月5日。

拉克罗斯病毒糖蛋白的突变支持Gc（1066-1087）作为融合肽的作用

马修·普拉斯梅耶¹, 萨曼莎·索尔丹, Karen M Stachelek先生, 苏珊·M·罗斯, 朱利奥·马丁·加西亚, 弗朗西斯科·冈萨雷斯-斯卡拉诺

附属公司

PMID： 17027056
预防性维修识别码：项目经理1820767
内政部： 2016年10月10日/j.virol.2006.08.050

拉克罗斯病毒糖蛋白的突变支持Gc（1066-1087）作为融合肽的作用

马修·普拉斯梅耶等。病毒学. 2007.

.2007年2月20日；358(2):273-82.

doi:10.1016/j.virol.2006.08.050。 Epub 2006年10月5日。

作者

马修·普拉斯梅耶¹, 萨曼莎·索尔丹, Karen M Stachelek先生, 苏珊·M·罗斯, 朱利奥·马丁·加西亚, 弗朗西斯科·冈萨雷斯-斯卡拉诺

附属

¹宾夕法尼亚大学医院西门3号神经病学系，美国宾夕法尼亚州费城云杉街3400号，邮编：19104-4283。

PMID： 17027056
预防性维修识别码：项目经理1820767
内政部： 2016年10月10日/j.virol.2006.08.050

摘要

拉克罗斯病毒（LACV）M段编码两种糖蛋白（Gn和Gc），作为神经侵袭的主要决定因素，在LACV感染的神经发生中起着关键作用。我们小组最近的一项研究表明，由Gc近三分之二的膜组成的区域，即氨基酸860-1442，在介导LACV融合和进入中至关重要。此外，计算分析确定了该区域的一部分氨基酸970-1350与两种α病毒（Sindbis病毒和Semliki Forrest病毒（SFV））的E1融合蛋白之间的结构相似性。在970-1350区域内，预计22-氨基酸疏水片段（1066-1087）与II类融合蛋白的融合肽在结构上相关。我们对这个22氨基酸片段中的关键氨基酸进行了定点突变，并确定了这些突变对融合和进入的功能后果。该疏水结构域中的几个突变在一定程度上影响了糖蛋白的表达，但所有突变要么使融合的pH阈值低于野生型蛋白的pH阈值，降低了融合效率，要么完全取消了细胞间融合和假型进入。这些结果，再加上上述计算模型，表明LACV Gc作为II类融合蛋白发挥作用，并支持Gc 1066-1087区域作为融合肽发挥作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。流式细胞术检测突变体Gc在QT6细胞中的表面表达**
如直方图所示，用M段结构转染QT6细胞，并用2%多聚甲醛固定20分钟。Gc检测采用两种构象单克隆抗体（807:31和807:22）的1:100（体积/体积）混合物的1:100稀释液。（A）如这些代表性直方图所示，Gc的表面表达在野生型LAC Gc和突变型LAC G c结构体之间是一致的：W1066A、G1067A和V1076A，在（B）结构体L1074A、S1077N和D1078A中，在（D）胰蛋白酶位点突变结构体R761H和R761A中。（C） G1038L、SFV FP或（D）LAC（Δ1066–1087）结构体未检测到背景以上的表面表达。

**图2。通过免疫荧光分析（IFA）表达突变结构**
用IFA结合两种非信息单克隆抗体检测Gc：807–15和807–25（1:1，vol/vol）。Gn由单克隆抗体检测（Jacoby等人，1993年）。此处显示了pCAGGS、LACV、LACV（W1066A）和LACVΔ1066–1087的代表性图像。

**图3。LAC Gc氨基酸区域1066–1087内的取代影响pH-依赖性细胞间融合**
用两种质粒转染效应细胞（QT6）：pCAGGS-M片段构建物和T7启动子下编码荧光素酶基因的质粒。BSR靶细胞感染了编码T7 RNA聚合酶（vTF1.1）的痘苗病毒，如材料和方法所示。在隔夜培养后，将效应细胞覆盖在目标细胞上，并使用HEPES-MES缓冲液短暂降低pH值。荧光素酶活性表明表达T7聚合酶的细胞与表达M段结构的细胞融合，然后在5小时后获得的细胞裂解液中进行测量。（A）降低融合或废除融合的氨基酸替代：G1066A、V1076A和W1066A。（B）氨基酸替换降低融合：L1074A、D1078A、S1077N（C和D）氨基酸改变，消除细胞表面表达，也消除融合活性：G1083L、SFV FP和Δ1066–1087。（E）位于761、LACV（R761A）和LACV的胰蛋白酶位点的点突变不影响细胞-细胞融合。

**图4。假定融合肽突变的LACV的MLV假型表明其转导CHME细胞的能力降低或减弱**
（A）融合LACV野生型和突变Gc的MLV假型颗粒的Western blot。按照材料和方法中的描述制备假型。在8–16%三甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶中分离后，将样品转移到0.2μm孔径的硝化纤维素膜上。上图：野生型和突变型Gc（如图所示）用单克隆抗体807:31以1:300稀释度检测。底部：使用识别MLV p30的单克隆山羊抗体检测MLV Gag。（B）将M段假型以1250 x g的浓度在4°C下旋转接种到CHME-5细胞上2小时。数据以多次实验的平均正负标准偏差表示，并通过Student’st吨测试）。与LACV（p<0.009）显著不同的结构用星号（*）表示，与对照（MLV-pCAGGS）显著不同（p<0.05）的结构用数字符号（#）表示。Gc（1066–1087）融合肽突变的假型病毒显示细胞进入减少或消失。在融合肽突变体构建物中，尽管与野生型LACV相比，它们介导假型病毒进入细胞的能力显著降低（p<0.02），但只有LACV（G1067A）和LACV（V1076A）介导假病毒进入细胞。

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