Protein expression and mRNA cellular distribution of the NKCC1 cotransporter in the dorsal root and trigeminal ganglia of the rat

doi:10.1016/j.brainres.2006.07.012

比较研究

.2006年9月27日；1112(1):146-58.

doi:10.1016/j.braines.2006.07.012。 Epub 2006年8月10日。

NKCC1共转运体在大鼠背根和三叉神经节的蛋白表达和mRNA细胞分布

西奥多·J·普莱斯¹, 肯尼思·哈格里夫斯, 费尔南多·塞尔维罗

附属公司

PMID： 16904086
预防性维修识别码：项目经理1899153
内政部： 10.1016/j.braines.2006.07.012

比较研究

NKCC1共转运体在大鼠背根和三叉神经节的蛋白表达和mRNA细胞分布

西奥多·J·普莱斯等。大脑研究. 2006.

.2006年9月27日；1112(1):146-58.

doi:10.1016/j.braines.2006.07.012。 Epub 2006年8月10日。

作者

西奥多·J·普莱斯¹, 肯尼思·哈格里夫斯, 费尔南多·塞韦罗

附属

¹麦吉尔大学麻醉与牙科系和麦吉尔疼痛研究中心，3655 Prom Sir William Osler，Montreal，QC，Canada H3G 1Y6。theodore.price@mcgill.ca

PMID： 16904086
预防性维修识别码：项目经理1899153
内政部： 2016年10月10日/j.rainres.2006.07.012

摘要

初级传入神经元在成年期对GABA保持去极化反应。这种GABA能反应的分子基础似乎是Na+K+2Cl-共转运蛋白NKCC1，它有助于维持较高的细胞内氯化物浓度。最近，有人提出NKCC1在伤害性加工中的作用，这使得我们能够及时地更好地了解NKCC1的分布在感觉神经节中。在这里，我们描述了在大鼠中，NKCC1 mRNA主要由中小直径背根（DRG）和三叉神经节（TG）神经元表达。评估NKCC1 mRNA与感觉神经元群体标记的共定位。在DRG中，许多NKCC1 mRNA表达神经元共定位外周蛋白（57.0+/-2.5%）、降钙素基因相关肽（CGRP，39.2+/-4.4%）或TRPV1免疫反应性（50.0+/-1.9%），而只有8.7+/-1.2%与大直径传入标记物（N52）共标记。同样，在TG中，NKCC1 mRNA表达神经元经常与外周蛋白共定位（50.0+/-3.0%）、CGRP（35.4+/-2.6%）或TRPV1免疫反应性（44.7+/-1.2%），而14.8+/-1.3%与N52抗体共标记。在DRG和TG的卫星胶质细胞（SGC）中也检测到NKCC1 mRNA。NKCC1蛋白与SGC标记NG2的克隆化证实了这些表达NKCC1的胶质细胞的表型。与原位杂交实验相比，我们在初级传入体细胞中没有观察到NKCC1免疫反应。这些发现表明，NKCC1在解剖学上合适的细胞中表达，以调节伤害性神经元中的GABA能反应。此外，这些结果表明NKCC1在与初级感觉传入密切相关的胶质细胞中发挥功能作用的可能性。

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数字

图1
NKCC1 ISH和IHC阳性对照：NKCC1 mRNA（A）和小脑内NT（B）和TEFS-2（C）抗体的免疫反应性。WM=白质，gr=颗粒层，M=分子层。向上的箭头示出了颗粒层中NKCC1阳性细胞的实例。箭头显示白质束中NKCC1 mRNA阳性胶质细胞的例子。每个面板的插图显示100×图像，显示在WM束（比例尺=10μm）中表达NKCC1 mRNA或蛋白的胶质细胞，以及脉络丛中NT（E）和TEFS-2（F）抗体的免疫反应。F中的插图显示小脑浦肯野细胞中KCC2 mRNA的表达。比例尺=100μm。

图2
评估背根、DRG、坐骨神经和脊髓背角中的NKCC1蛋白和mRNA以及DRG中NKCC1 mRNA的表达：（A）典型的Western blots，说明在160 kDa处从背根（1）、DRG（2）、坐骨神经节（3）和背角（4）蛋白匀浆中检测到NKCC1蛋白质的存在（10μg蛋白质/车道）β-III微管蛋白用作负荷控制。（B）典型的RT-PCR显示NKCC1 mRNA在背根（1）、DRG（2）、坐骨神经（3）和背角（4）中的存在以及NKCC2的缺失。肾（5）RNA被用作NKCC2的阳性对照。GAPDH mRNA用作负荷对照。（C） DRG中NKCC1 mRNA的高倍（100×）图像和相应的CGRP IHC图像（D）。向下箭头：NKCC1 mRNA和CGRP表达神经元。箭头：大直径NKCC1 mRNA和CGRP阴性神经元。凹面对角线箭头：DRG中NKCC1 mRNA表达的胶质细胞。其中许多细胞似乎是卫星胶质细胞（SGCs），因为它们的位置包裹着神经元胞体。

图3
原位杂交NKCC1 mRNA结合免疫组织化学检测DRG中感觉神经元群体标志物：NKCC1 m RNA（A、C、E和G）的40倍代表性显微照片结合免疫组织化检测外周蛋白（B）、N52（D）、CGRP（F）和TRPV1（H）。成对的图像来自腰椎DRG双标切片的同一区域。向上箭头表示神经元示例，其中标记物与NKCC1 mRNA共定位明显。C和D中的水平箭头表示不含N52免疫反应性的NKCC1mRNA阳性神经元。向下箭头表示相反。比例尺=100μm。

图4
NKCC1 mRNA原位杂交结合免疫组织化学检测TG中感觉神经元群体标记物：NKCC1 m RNA（A、C、E和G）的代表性40倍显微照片结合免疫组织化检测外周蛋白（B）、N52（D）、CGRP（F）和TRPV1（H）。成对的图像来自于腰椎TGs双标切片的同一区域。向上箭头表示神经元示例，其中标记物与NKCC1 mRNA共定位明显。C和D中的水平箭头表示不含N52免疫反应性的NKCC1 mRNA阳性神经元。向下箭头表示相反。比例尺=100μm。

图5
在DRG和TG中，NKCC1 mRNA与感觉神经元群体标记物的共定位百分比以及神经元大小分布：（A）NKCC1阳性神经元的百分比显示为在DRG与TG中也表达外周蛋白、N52、CGRP或TRPV1的神经元的功能(n个=每种情况3）。（B）表达外周蛋白、N52、CGRP或TRPV1的神经元百分比显示为在DRG和TG中共同表达NKCC1 mRNA的神经元的功能。NKCC1 m RNA阳性DRG（C）和TG（D）神经元的神经元大小相对频率显示为5μm bins。这个年轴显示了整个群体中处于给定5μm大小范围内的神经元的百分比。还显示了TRPV1免疫反应（小直径标记）和N52免疫反应（大直径标记）神经元大小频率(n个=每种情况3）。

图6
DRG中NKCC1 mRNA与CaMKIIα蛋白的克隆化：同一DRG切片中具有CaMKIIIα（B）免疫反应性的NKCC1 m RNA（A）的代表性40倍显微照片。向上箭头表示神经元共同表达NKCC1 mRNA和CaMKIIα蛋白。比例尺=100μm。（C）腰椎DRG切片中NKCC1 mRNA和CaMKIIα蛋白的结肠化率(n个=每种情况3）。

图7
脊髓中NKCC1和KCC2 mRNA表达，缺乏NKCC2表达：图像显示在整个腰椎脊髓切片上原位杂交NKCC1 mRNA（A）和KCC2 m RNA（B）。图像是从一系列10倍的显微照片中重建出来的，这些照片拍摄于整个脊髓切片。单个DRG显微照片显示，DRG中缺少KCC2（C）和NKCC2（D）mRNA表达，而NKCC2 mRNA在肾脏髓质（E）中强烈表达。比例尺=100μm。

图8
DRG中NKCC1免疫反应性与N52或NG2的共焦图像：使用NT抗体（B和E）与N52（A）或NG2（D）的NKCC1（NT）免疫反应性的典型共焦显微照片。利用TEFS-2抗体（H和K）与N52（G）或NG2（J）的NKCC1（TEFS-2）免疫反应性。面板C、F、I和L中显示了各自的合并图像。垂直箭头显示了B、C和E中神经元周围的NKCC1（NT）免疫反应性SGC，以及F或NKCC1，TEFS-2，H、I和K和L中神经元周围免疫反应性的SGC。D和J中的垂直箭头显示这些SGC中的NG2免疫反应性。E和F以及K和L中的水平箭头显示不表达NG2的NKCC1（NT）免疫反应性非神经元细胞。A、C、G和I中的星形细胞显示了被NKCC1（分别为NT或TEFS-2）免疫反应细胞包围的N52免疫反应神经元。

图9
NKCC1免疫反应与TRPV1的共焦图像：NKCC1、NT（A）或TEFS-2（D）的代表性共焦显微照片，与TRPV（B和E）的免疫反应。面板C和F中显示了各自的合并图像。垂直箭头表示神经元周围的NKCC1（NT（A和C）或TEFS-2（D和F））免疫反应性SGC。B、C、E、F中的星号表示TRPV1免疫反应神经元，其周围为NKCC1免疫反应性SGC。

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