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比较研究
.2005年12月19日；202(12):1691-701.
doi:10.1084/jem.20050915。

多柔比星诱导肿瘤细胞死亡的半胱氨酸蛋白酶依赖性免疫原性

诺埃利亚·卡萨雷斯 1, 玛丽·奥·佩基尼奥特, 安托万·泰斯尼尔, 弗朗索瓦·吉林赫利, 圣芬罗, 纳撒利·查普特, 伊丽莎·施密特, 艾哈迈德·哈迈, 桑德拉·赫瓦斯·斯图布斯, 米歇尔·奥贝德, Frédéric Coutant餐厅, 迪迪埃·梅蒂维尔, 伊芙琳·皮查德, 皮埃尔·奥古里尔, 杰拉德·皮尔龙, 卡门·加里多, 劳伦斯·齐特沃格尔, 吉多·克罗默
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比较研究

多柔比星诱导肿瘤细胞死亡的半胱氨酸蛋白酶依赖性免疫原性

诺埃利亚·卡萨雷斯等。 实验医学杂志. .

摘要

全身抗癌化疗具有免疫抑制作用，主要导致非免疫原性肿瘤细胞死亡。这里，我们表明，即使在没有任何佐剂的情况下，因蒽环类药物而死亡的肿瘤细胞也能引发有效的抗肿瘤免疫反应，抑制接种肿瘤的生长或导致既定肿瘤的消退。虽然antracyclins和丝裂霉素C都通过caspase激活诱导细胞凋亡，但只有蒽环素诱导的免疫原性细胞死亡是免疫原性的。通过Z-VAD-fmk抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶或转染杆状病毒抑制剂p35不能抑制阿霉素（DX）诱导的细胞死亡，但抑制了几种啮齿动物肿瘤模型中死亡肿瘤细胞的免疫原性。树突状细胞（DC）或CD8+T细胞的耗竭在体内消除了对DX处理的凋亡肿瘤细胞的免疫反应。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制抑制DX杀伤细胞被DC吞噬的能力，但对其诱导DC成熟的能力没有影响。体外DX治疗后，新切除的肿瘤变得具有免疫原性，肿瘤内接种DX可在免疫活性小鼠中触发已建立肿瘤的消退。这些结果描述了一种生成癌症疫苗和刺激体内抗肿瘤免疫反应的程序。

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数字

图1。
图1。
CT26细胞中诱导的不同细胞死亡模式的体外表征。（A） 用材料和方法中规定的指示试剂对体外处理的细胞进行FACS分析。ZVAD、Z-VAD-fmk。数字表示细胞百分比（X±SD，n个=5）在每个象限。（B） 对按A处理的细胞进行免疫印迹分析。对细胞提取物进行活化caspase 3（Casp3a）、HMGB-1和HSP-70的免疫检测。（C） 用DAPI（蓝色）对细胞进行TUNEL染色（绿色）。TUNEL百分比+细胞（X±SEM，n个=3）已确定。（D） 透射电子显微镜。显示了具有代表性的显微照片。显示染色质浓缩的凋亡细胞用“A”标记。（E）用A中指示的试剂处理的细胞被洗涤和铺板，以确定存活克隆的频率，将未处理细胞的对照值定义为100%。结果代表了三个独立的实验。
图2。
图2。
不同细胞死亡类型的免疫原性。（A） DX-和DXZ处理的细胞在数值/数值老鼠。将按图1处理的细胞皮下注射（3×106/鼠标）。（B） 免疫活性BALB/c中DX-和DXZ处理细胞的肿瘤演变。注意，MC或F/T处理的小鼠也没有形成肿瘤。（C） DX处理的肿瘤细胞的免疫原性作用。将BALB/c小鼠一侧的活体肿瘤细胞注射到另一侧，另一侧注射DX-、DXZ-、MC-或F/T处理的细胞，并监测肿瘤的演变。（D） DX处理细胞诱导的持续、特异性抗肿瘤免疫。用120天后仍无肿瘤的DX处理的CT26细胞免疫的动物或年龄匹配的对照小鼠，用CT126细胞或无关的TSA肿瘤细胞系进行攻击。（E） DX处理细胞诱导的抗肿瘤免疫过继转移。BALB/c小鼠静脉注射107来自原始对照动物或用DX处理的CT26细胞免疫的动物的脾细胞保持无瘤状态（如B和D），然后皮下注射5×105肿瘤细胞。（F） 抗肿瘤疫苗接种时间的影响。如图1所示处理的CT26细胞1与活肿瘤细胞同时注射（与C中同时注射）或在用活肿瘤细胞攻击前1周注射一次（预防性免疫；n个=每组15人）。（G） 用其他蒽环类药物替代DX。动物注射用柔红霉素（DA）或依达比星（ID）处理过的CT26细胞，而不是DX或仅PBS（CO），同时注射到对侧的活CT26细胞的生长如C所示。所有数字代表三到六个独立实验。*，与对照组（CO）相比，P<0.05。请注意，肿瘤的生长曲线只显示到伦理准则要求杀死动物的水平。
图3。
图3。
DX对凋亡肿瘤细胞免疫原性的贡献。（A） DX并入CT26细胞。如图1所示，在没有或存在DX的情况下处理肿瘤细胞24小时，并通过评估FACS中DX特异性红色荧光来测量DX在细胞中的掺入量（左）。或者，通过在MC中长时间培养（如图1所示）杀死CT26细胞，然后在培养、洗涤和DX掺入测定的最后15分钟内选择性添加DX（右）。（B） DX在体内的免疫效果。A组（DX、MC或MC加DX）中处理过的细胞在预防性环境下皮下注射（如图2F所示），1周后用另一侧的活CT26细胞激发，然后监测肿瘤生长。
图4。
图4。
胱天蛋白酶抑制剂p35对免疫原性的抑制作用。（A） FACS分析仅转染载体（Neo）或单独培养或在DX存在下培养的p35的CT26细胞，如图1 A所示。数字表示细胞百分比（X±SD，n个=5）在每个象限。（B） Neo或p35转染细胞未经治疗（100%值）或接受DX治疗后的克隆形成存活率。（C和D）将新转染、DX处理或p35转染DX处理细胞同时注射到对侧的动物体内CT26肿瘤的演变。请注意，只有新表达的DX处理细胞具有肿瘤免疫性（P<0.01）。
图5。
图5。
死亡肿瘤细胞对树突状细胞的影响。（A和B）Flt3L注射小鼠脾脏DC对DX-、DXZ-或MC处理的细胞（用CMTMR染色）的体外吞噬作用。典型的FACS图如A所示，纯化DC亚群（绿色）吞噬的死亡肿瘤细胞（红色）的共焦图像如B所示。（C）LPS（阳性对照）和死亡或死亡的CT26细胞诱导脾DC的DC成熟。A和C中的百分比值是三个独立测定值±SD的平均值。（D）Z-VAD-fmk未能抑制DC对DX处理的CT26细胞的吞噬作用。在显示浓度的Z-VAD-fmk存在下，将D中生成的DC与两倍多的DX处理的CT26细胞孵育90分钟，并且含有死亡或死亡CT26细胞的DC的百分比如a中所示。（E）DX未能激活DC。以LPS作为阳性对照或以指定浓度的DX和凋亡细胞（膜联蛋白V）的频率激活骨髓来源的DC+)和CD86+细胞通过免疫荧光和细胞荧光分析进行检测。A和C–E中的百分比值是三次独立测定±SD的平均值。
图6。
图6。
由死亡肿瘤细胞诱导的免疫效应物的特征。（A） 免疫小鼠中DX-和DXZ处理细胞的CTL反应。对只接种PBS（CO）、DX处理的CT26细胞或DXZ处理的CT26-细胞的动物脾脏T细胞进行测试，以检测其对免疫显性H2L脉冲的同基因细胞的裂解能力d日-限制性CT26衍生肽SPSYVYHQF。左侧显示了单个小鼠的典型CTL反应，右侧显示了平均值。R和NR分别指应答者和非应答者。*，与对照组（CO）相比，P<0.01。（B） 裸鼠对DX处理的CT26细胞产生免疫反应的失败。野生型或数值/数值BALB/c小鼠接种DX处理的CT26细胞1周后，将活CT26细胞注射到对侧，监测无瘤生存率。（C） CD8的要求+而非NK细胞的抗肿瘤免疫反应。野生型BALB/c小鼠在以死亡（DX处理）和活（未处理）CT26细胞为攻击对象，每隔1周将CD8或NK标记物asialo-GM1特异性耗尽抗体腹腔注射至对侧。
图7。
图7。
特异性CTL和DC对DX处理的肿瘤细胞免疫反应的贡献。（A） CD8的百分比+表达TCR的淋巴结细胞，其与H-2K呈递的OVA衍生肽SIINFEKL相互作用b条用肽加佐剂（P+A）或DX、DX F/T（用DX和F/T处理的细胞）、DXZ-、MC-和F/T-处理的B16-OVA细胞激发后5天（三个实验）。（B） 特定CD8的绝对数+每个淋巴结的细胞数如A所示。值为X±SD(n个= 3). （C） 用SIINFEKL在同一实验中进行体外培养后测得的IFN-γ产生。对照值<50 pg/ml。（D）DC耗竭对特定T细胞积累的影响。在树突状细胞中特异性表达白蚁毒素（DT）受体的转基因小鼠，单独用PBS或消耗树突状公司的白蚁毒素剂量进行预处理。然后用DX处理的B16-OVA细胞将小鼠激发到食物垫中。48小时后恢复引流淋巴结，并进行染色以同时检测CD8和OVA肽特异性T细胞受体。显示了具有代表性的FACS象形图，数值为X±SD(n个= 3).
图8。
图8。
在不同的啮齿动物模型中接种DX处理的黑色素瘤或结肠癌细胞的抗肿瘤疫苗。（A） 将活CT26细胞静脉注射到动物体内后观察到的无转移小鼠的百分比，这些动物同时注射了仅含载体（CO）的细胞或如图1所示生成的死亡肿瘤细胞。未经治疗的对照组发生46±22个转移（X±SD，n个= 46). （B） 静脉注射活CT26细胞前14天和7天用DX处理的CT26细胞进行两次免疫的效果。A和B中的数据来自三个独立实验。*，与对照组（CO）相比，P<0.001。（C） 将DX处理的B16A2细胞两次注射到HLA转基因小鼠中。A2用活B16A2细胞挑战对侧腹前1周和2周。*，与对照组（CO）相比，P<0.05。（D） 同时皮下注射死亡（DX-或DXZ治疗）肿瘤细胞的方案适用于受到PROb细胞攻击的BDIX大鼠。*，与对照组（CO）相比，P<0.001。这个实验重复了三次，得到了类似的结果。
图9。
图9。
体内外诱导免疫原性细胞死亡。（A） 接种新鲜切除或冷冻保存的CT26肿瘤细胞的小鼠肿瘤的演变，这些肿瘤未经治疗（CO）或接受DX治疗。（B） 瘤内化疗对免疫活性BALB/c小鼠接种CT26结肠癌细胞生长的影响。先前接种活CT26细胞的BALB/c小鼠在接种肿瘤细胞后的约14天内触诊到肿瘤细胞时，立即接受DX、DXZ或MC瘤内注射（箭头所示），并监测肿瘤生长。虽然一些DX治疗的动物肿瘤生长正常(n个=12）或肿瘤生长的简单延迟(n个=12），其他动物表现出稳定的疾病(n个=7）或肿瘤完全消退(n个= 9). （C） 通过肿瘤内注射DX（如B）或年龄匹配的对照（CO）小鼠与活CT26细胞治愈的动物的再激发。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。（D） 肿瘤内注射DX未能在数值/数值携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠。除了动物免疫缺陷外，实验按B进行。（E） PROb大鼠结肠癌模型的瘤内注射。免疫活性或数值/数值携带PROb肿瘤的BDIX大鼠接受DX、DXZ或MC瘤内注射，并监测肿瘤生长。
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