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.2006年1月；26(1):221-9.
doi:10.1128/MCB.26.1222-209.2006。

氧化和亲电应激通过抑制Keap1的泛素化活性激活Nrf2

小林章 1, 月尔康, 和泰义子, Kit I动力钳, 柴田高弘, 内田浩二, 山本正之
附属公司

氧化和亲电应激通过抑制Keap1的泛素化活性激活Nrf2

小林章等。 分子细胞生物学. 2006年1月.

摘要

Keap1-Nrf2系统是针对氧化和/或亲电应激的细胞保护基因表达的主要调节途径。Keap1在这个系统中充当压力传感器蛋白。虽然Keap1在非应激条件下构成性地抑制Nrf2活性，但氧化剂或电泳剂会刺激Keap1活性的抑制，从而诱导Nrf2活化。然而，在应激状态下Nrf2从Keap1阻遏中解放出来的确切分子机制仍有待阐明。我们假设，氧化和亲电应激通过影响Keap1介导的Nrf2快速转换，诱导Nrf2的核积累，因为蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺减少了这种积累。虽然Keap1的Cys273和Cys288残基都是抑制Nrf2核积累所必需的，但用电泳或将这些半胱氨酸残基突变为丙氨酸的细胞处理在体内或体外均不影响Keap1与Nrf2的关联。相反，这些治疗损害了Keap1介导的Nrf2蛋白酶体降解。这些结果支持了以下观点：暴露于应激后从头合成的Nrf2蛋白通过绕过Keap1门积聚在细胞核中，并且氧化和亲电应激的感觉机制与Nrf2的降解机制密切相关。

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图1。
图1。
氧化/亲电应激刺激新生Nrf2蛋白的核积累。野生型MEF细胞用tBHQ（泳道2至9；终浓度，100μM）或二甲基亚砜（泳道1和10至13）在存在（泳道6至13）或不存在（泳道1至5）蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（10μM）的情况下处理不同时间点，如图所示。制备核提取物，并使用抗Nrf2和抗层粘连B抗体（顶部和底部面板）进行免疫印迹分析。
图2。
图2。
Keap1需要Cys273和Cys288来抑制Nrf2活性。（A） IVR结构域半胱氨酸突变体的结构示意图。（B） 通过荧光素酶分析测定Keap1抑制活性。将Nrf2和Keap1野生型（3和9道）或半胱氨酸突变体（4至6、10和11道）（分别为90 ng和10 ng）的表达质粒转染NIH 3T3细胞（2×104)与pNQO1-ARE报告质粒（50 ng）和pRL-TK（50 ng。转染后36小时，根据制造商的说明测量荧光素酶活性。检测分为两次，共三次。
图3。
图3。
Keap1-C273和288A突变体固着但不降解细胞质中的Nrf2。（A） 将Nrf2和标记Keap1或Keap1-C273&288A突变体的表达质粒转染到Cos7细胞中。转染后36小时，使用抗Nrf2（a至d）和抗Flag（M2）（e至h）抗体对细胞进行免疫组织化学染色。细胞核用DAPI染色（i至l）。（B） Nrf2的亚细胞定位分为三类：主要是细胞质定位（C>N，蓝条），细胞质和核间大致相等的定位（C=N，黄条），以及主要是核定位（C<N，红条）。显示了100个细胞内的亚细胞定位。（C） 使用转染细胞的分馏细胞提取物进行免疫印迹分析。转染方法如上所述。将细胞分为细胞质（C）和细胞核（N）组分，然后进行免疫印迹分析。抗lamin B和抗α-微管蛋白抗体分别作为核和细胞质提取物的标记物。
图4。
图4。
减少的Cys273和Cys288对于Nrf2的泛素依赖性降解至关重要。（A） Cys273和Cys288的丙氨酸突变或氧化损害Keap1介导的Nrf2降解。通过体内降解试验监测Keap1的降解活性。如图所示，将Nrf2和野生型或C273和288A突变型Keap1的表达质粒（分别为2μg和1.5μg）转染到Cos7细胞中。共转染EGFP质粒（50 ng）以验证转染效率。转染后24 h，用二甲基亚砜（1至3和5道）或tBHQ（4道；最终浓度，100μM）处理细胞12 h。制备全细胞提取物，并使用抗Nrf2和抗GFP抗体进行免疫印迹分析（分别为顶部和底部面板）。（B） Cys273和Cys288的丙氨酸突变或氧化损害Keap1介导的Neh2结构域泛素化。进行体内泛素化分析。本试验中使用了GFP融合的Neh2结构域，该结构域包含Keap1依赖的泛素化位点（Neh2-GFP）。如图所示，将Neh2-GFP和野生型Keap1或Keap1-C273&288A突变体的表达质粒以及His标记的泛素（HisUb）质粒转染到293T细胞中。转染后24小时，在不含（1至3道和5道）或存在（4道；最终浓度，100μM）tBHQ的情况下，用MG132（最终浓度，2μM）处理细胞12小时2+亲和纯化。用抗Nrf2抗体进行免疫印迹分析，观察沉淀。
图5：。
图5：。
氧化/亲电应激不会导致Keap1-Nrf2复合物解离。（A） 用免疫沉淀法检测体内tBHQ治疗对Keap1和Nrf2相关性的影响。将Flag-tagged Nrf2和Keap1（分别为2μg和1.5μg）的表达质粒转染293T细胞。转染后24小时，用tBHQ（泳道4，100μM终浓度）或蛋白酶体抑制剂MG132（泳道5，2μM终浓度）处理细胞12小时。制备全细胞提取物，并使用抗Flag抗体珠进行免疫沉淀实验。使用抗Keap1抗体和抗Nrf2抗体（分别为顶部和中部面板）通过免疫印迹分析显示免疫沉淀物。用抗Keap1抗体的免疫印迹分析监测全细胞提取物中Keap1的表达水平（下图）。（B和C）体外tBHQ治疗不会导致Keap1-Nrf2复合物分离。如上所述进行转染，并从转染的293T细胞制备全细胞提取物。使用抗Nrf2抗体和抗Keap1抗体（分别为B、顶部和底部面板）通过免疫印迹分析监测Nrf2和Keap1突变体的表达水平。用DMSO（C，第4和第8道）或tBHQ（第5和第9道，10μM最终浓度；第6和第10道，50μM最终密度；第7和第11道，500μM最后浓度）在4°C下处理全细胞提取物4小时，并用抗Flag抗体珠进行免疫沉淀。使用抗Keap1和抗Nrf2抗体（分别为顶部和底部面板）通过免疫印迹分析显示沉淀。将分别转染空的、野生型Keap1和C273和288A突变Keap1表达载体的细胞的免疫沉淀物加载到第1到第3通道。
图6。
图6。
氧化/亲电应激不影响Keap1-Nrf2复合物的形成。生物素化15d-PGJ对Keap1的亲电改性2不影响Keap1-Nrf2复合物的形成。用生物素化15d-PGJ处理表达Keap1的293T细胞2（生物-PGJ2第1、4和5车道；制备全细胞提取物，并与表达Nrf2（1、3和5道）或野生型（2和4道）细胞的全细胞提取物混合。使用亲和素珠从混合细胞提取物中沉淀生物素化Keap1，并使用抗Nrf2和抗Keap1抗体对沉淀进行免疫印迹分析（分别为顶部和底部面板）。
图7。
图7。
Nrf2激活机制的示意图模型，与Keap1介导的Nrf2降解紧密耦合。在稳态条件下，Nrf2被Keap1-Cul3复合物隔离在细胞质中，并以泛素蛋白酶体依赖的方式快速降解。这种Keap1介导的降解活性需要Keap1的两个活性半胱氨酸残基（Cys273和Cys288）。在氧化/亲电应激激发后，Keap1的这些半胱氨酸残基修饰抑制了Keap1-Cul3复合物与Nrf2的泛素结合，从而触发Keap1门的开放，导致Nrf2核聚积。
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