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.2005年11月16日；24(22):3834-45.
doi:10.1038/sj.emboj.7600847。 Epub 2005年11月3日。

PK头孢菌素介导的波形蛋白磷酸化控制整合素循环和运动

约翰娜·伊瓦斯卡 1, 卡罗琳娜·武奥里洛托, 托马斯·霍维宁, 岩泽一郎, 稻崎正男, 彼得·帕克
附属公司

PK头孢菌素介导的波形蛋白磷酸化控制整合素循环和运动

约翰娜·伊瓦斯卡等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

PKCepsilon控制内吞β1整合素向质膜的转运，调节定向细胞运动。波形蛋白（Vimentin）是一种在上皮细胞转化时上调的中间丝蛋白，这里显示它是再循环整合素室中PKCepsilon的近端靶点。抑制PKC和波形蛋白磷酸化后，整合素被困在囊泡中，细胞向基质的定向运动严重减弱。体外重组实验表明，PK头孢西隆在一种选择性磷酸化的波形蛋白复合物中与含整合素的内化囊泡分离。波形蛋白上PKC（受控）位点的突变和变体的异位表达导致细胞内PKCepsilon/整合素阳性小泡的积聚。最后，异位野生型波形蛋白的引入显示出以PKCepsison依赖的方式促进细胞运动；波形蛋白PKC（受控）位点上的丙氨酸取代消除了波形蛋白诱导细胞迁移的能力，而用酸性残基取代这些位点使波形蛋白能够拯救PKCepsilon空细胞的运动。我们的结果表明，PKC介导的波形蛋白磷酸化是整合素通过细胞的关键过程。

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数字

图1
图1
含整合素的内吞小泡上的PKC底物。(A类)为了确定囊泡室中的近端PKC靶点，将来自BIM-I处理的PKC表达细胞（PKC RE）的生物素化囊泡重新悬浮在小体积的缓冲液中，并在有花萼蛋白a、P32γATP和PKC抑制剂BIM-I在37°C下指示1小时。反应后，在链霉亲和素-Dynabeads上收集所有生物素化蛋白，并在SDS-PAGE上进行解析，然后进行考马斯染色和放射自显影。从凝胶中切下BIM-I敏感的磷酸化条带，进行胰蛋白酶化，并使用MS指纹图谱鉴定为波形蛋白和肌球蛋白重链II A或B。(B类)波形蛋白和MHCII的亚细胞定位随着PKC的抑制而改变。用BIM-I处理PKCɛRE细胞90分钟或不处理，然后进行蔗糖梯度分级（见材料和方法）。通过TCA沉淀回收组分中的蛋白质，并用抗PKCɛ、抗波形蛋白、抗MHCIIA和抗MHCIIB抗体进行Western blot分析。在BIM-I处理后，发现波形蛋白在PKC阳性致密室中积聚（第7-9段）。(C类)BIM-I治疗诱导波形蛋白裂解和PKC阳性小泡的形成。显示PKC RE细胞中波形蛋白和PKC的双色免疫荧光染色。在未经处理（对照）或1μM BIM-I（BIM-I）培养90分钟后，将细胞电镀，并允许纤维连接蛋白扩散30分钟。箭头表示BIM-I处理细胞中PKCɛ和波形蛋白染色的一些重叠区域。钢筋10μm。(D类)从BIM-I处理的PKCɛRE细胞分离的囊泡中富集波形蛋白和PKCɥ。免疫电子显微镜显示PKCɛ（10 nm蛋白A-gold，大箭头）和波形蛋白（15 nm蛋白A-gold，小箭头）的双重标记。
图2
图2
波形蛋白的PKC依赖性磷酸化和调节囊泡室中波形蛋白结合。(A类)用PKC抑制剂BIM-I处理PKC阴性（−/−）和PKC RE细胞，并用2D凝胶电泳解析等蛋白负载的全细胞裂解物，然后转移到硝化纤维素上。丝氨酸磷酸化是通过使用抗磷胺抗体（左侧面板）进行印迹检测的，然后用抗波形蛋白进行剥离和重制，以检测内源性蛋白质的定位（右侧面板）。除了波形蛋白外，磷酸-胺抗体还检测到一个未知的蛋白质斑点，其分子量略高于波形蛋白（标记为“*'). 对应于波形蛋白的磷酸丝氨酸信号用箭头表示。(B类)将来自BIM-I处理的PKCɛRE细胞的生物素化小泡重新悬浮在小体积的缓冲液中，并在ATP和GTP存在下，在PKCƓ/−细胞衍生的细胞液中培养，以支持PKC催化活性，或如图所示在37°下单独缓冲1 h，然后在平衡梯度上折射。将每个组分的生物素化蛋白收集在链霉亲和素Dynabeads上，结合蛋白在SDS-PAGE电泳后进行Western blot分析。(C类)从BIM-I处理的PKCɛRE细胞中分离的囊泡重新悬浮在小体积缓冲液中，并在37°C的缓冲液中在ATP和GTP的存在下培养1 h。将反应物稀释成两个体积的冰镇HEPES缓冲液，并在100000下沉淀克回收剩余的膜结合蛋白。从可溶性部分（IP）中免疫沉淀波形蛋白，并用TCA沉淀浓缩剩余的可溶性蛋白。用Western blot分析所有三个组分的蛋白质，以检测PKCɛ和波形蛋白。(D类)将从BIM-I处理的PKCɛRE细胞中分离的小泡重新悬浮到小体积缓冲液中，并在37°C的缓冲液中在ATP、GTP和BIM I的存在下培养1小时。将反应物稀释成两个体积的冰镇HEPES缓冲液，并在100000下沉淀克回收剩余的膜结合蛋白；剩余可溶性蛋白用TCA沉淀浓缩。用Western blot分析两个组分的蛋白质，以检测特定位点的波形蛋白磷酸化。在磷酸抗体检测后，通过剥离和重制检测波形蛋白分布。波形蛋白抗磷丝氨酸38的代表性印迹如（D）所示。(E类)直方图显示了在代表性实验中膜结合部分和可溶性部分所示位置磷酸化的波形蛋白分布的量化。(F类)显示了波形蛋白抗磷丝氨酸6的代表性印迹。
图3
图3
波形蛋白诱导的细胞运动依赖于PKC和波形蛋白的磷酸化。(A类)MCF7细胞和(B类)用空载体（pCMV-Script）或野生型（pCMV-vim）人类波形蛋白与荧光素酶编码载体（转染效率～80%）短暂共转染PKCɛnull（−/−）和PKCɥRE细胞。使用10μg/ml BSA（随机运动）或FN（触觉）对Transwell过滤器底部进行涂层。转染后36小时，104每个孔的细胞迁移16小时。用胰蛋白酶分离迁移的细胞，用DNA染料溶解并定量（见材料和方法）。还对细胞的一部分进行了裂解和荧光素酶活性分析，并将迁移归一化为转染效率。插入的面板显示了pCMV-vim瞬时转染这些细胞前后波形蛋白的表达水平。(C类)PKCɛRE细胞波形蛋白免疫荧光染色。用wt人波形蛋白或波形蛋白（S4,6,7,8,9A）瞬时转染细胞。在转染后36小时，细胞被镀上，在未经处理（对照）或1μM BIM-I（BIM-I）培养90分钟后，让细胞在纤维连接蛋白上扩散30分钟。棒材10μm。(D类)显示了PKCɛRE细胞中内源性小鼠波形蛋白（绿色）和外源性表达人类波形蛋白的免疫荧光染色。用wt人波形蛋白或波形蛋白（S4,6,7,8,9A）瞬时转染细胞。转染后36小时，细胞被镀上，并在纤维连接蛋白上扩散1小时。Bar 10μm。(E类)PKCɛRE细胞与空载体（pCMV-Script）、wt人波形蛋白（pCMV-vim）、波形蛋白蛋白（S4,6,7,8,9A）或波形蛋白基因（S6,33,38,50,55,71,82A）以及荧光素酶编码载体瞬时共转染。转染细胞对纤维连接蛋白的结合力如上所述进行分析（平均值±标准差。，n个=5,*P（P）<0.05,†P（P）>0.05). 插入的面板显示了PKC和异位人类波形蛋白在这些细胞中的表达水平。(F类)PKCɛnull（−/−）细胞与wt人波形蛋白、波形蛋白（S4,6,7,8,9A）或波形蛋白与荧光素酶编码载体瞬时共转染。通过计算迁移细胞的数量来确定转染细胞对纤维连接蛋白的亲合性，并将迁移归一化为转染效率（平均值±s.d。，n个=5,*P（P）<0.05). 插入的面板显示了这些细胞中异位人类波形蛋白的表达水平。
图4
图4
波形蛋白磷酸化改变α2β1整合素和PKC的细胞定位。(A类)显示了PKCɛ（绿色）和体外表达的人类波形蛋白（红色）的显微图像。将PKCɛRE细胞与野生型（wt）人类波形蛋白、波形蛋白（S4,6,7,8,9A）或波形蛋白共同瞬时转染。转染后48小时，细胞被镀上，并在纤维连接蛋白上扩散1小时。Bar 10μm。(B类)将GFP-标记的α2-整合素单独（顶行）或GFP-整合素、wt人波形蛋白或波形蛋白（S4,6,7,8,9A）（mutVim）与GFP-PKC瞬时转染PKC RE细胞。在转染后36小时，细胞被镀上，并允许在未经处理（对照）或存在1μM BIM-I（BIM-I）的胶原蛋白培养基上扩散。GFP-α2转染的PKCɛRE细胞的PKC（红色）免疫荧光染色。棒材10μm。(C类)PKCɛRE细胞与wt人波形蛋白或波形蛋白（S4,6,7,8,9A）瞬时共转染。在转染后48小时，细胞被镀上，并在纤维连接蛋白上扩散1小时，然后用可切割生物素进行表面标记。让细胞内化整合素20分钟，细胞表面残留的生物素被裂解。细胞表面生物素的裂解后，在+37°C的温度下进行第二次培养，培养时间为指定的时间，随后的裂解步骤将回收到细胞表面的任何生物素去除。使用特异性抗整合素抗体和HRP结合的抗生物素抗体，通过ELISA测定生物素化β1-或α2-整合素的数量。数据表示为15分钟孵育期间保留在细胞内的内化受体百分比（平均值±标准差。，n个=3,*P（P）<0.05). (D类)用wt人波形蛋白或波形蛋白（S4,6,7,8,9A）瞬时转染PKCɛRE细胞。转染后48小时，结合的转铁蛋白在+4°C下与细胞表面结合30分钟，然后在+37°C下追逐指定时间，同时存在过量的未标记转铁蛋白。每个时间点转染细胞和未转染细胞的平均内部荧光强度（红道）（平均值±s.d。；n个=2）。
图5
图5
α2-整合素小泡沿着轨道状路径定位到新生的膜突起。用活细胞共聚焦显微镜研究了α2-GFP转染的稳定人骨肉瘤Saos-2细胞粘附胶原。整合素小泡离开细胞中心，向丝状突起移动。电影中的静像（参见补充视频1）如图所示。小向下箭头沿着小泡在不同时间点的路径，水平箭头指示每个图像中的相同位置。
图6
图6
波形蛋白/整合素循环的工作模型示意图。该图说明了与整合素流量相关的波形蛋白行为的预测周期。第一步是波形蛋白低聚物与整合素回收室的结合（i）。随后是PKC的募集（ii），随后是PKC调节的波形蛋白N端磷酸化和波形蛋白-PKC复合物的释放（iii）。这种释放的复合物与中间丝（IFs）相关，其中波形蛋白在N末端脱磷酸化，PKC解离（iv）。BIM-I对PKC催化活性的抑制阻断了步骤（iii），而波形蛋白N末端的酸化导致PKC与IFs的长时间结合（见图4）。整合素的重新循环是有效迁移所必需的，并且在缺乏PKCɛ或存在非N-末端磷酸化形式的波形蛋白的情况下这是有缺陷的，这两种情况都会影响步骤（iii）。类似地，波形蛋白N末端的酸化绕过了PKC的要求（见结果）。
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