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比较研究
.2005年10月17日；202(8):1075-85.
doi:10.1084/jem.20051511。

CD4+CD25+调节性T细胞以转化生长因子-β依赖的方式抑制自然杀伤细胞功能

弗朗索瓦·吉林赫利 1, 塞德里克·梅纳德, 马加里·泰尔梅, 卡罗琳·弗朗特, 朱利安·泰伯, 纳撒利·查普特, 皮埃尔·普伊格, 索菲·诺沃, 伯纳德·埃斯库迪尔, 埃里克·维维尔, 阿克塞尔·莱斯尼, 卡罗琳·罗伯特, 珍妮·伊夫·布雷, 杰基·伯纳德, 苏菲·凯拉·祖克曼, 安东尼奥·弗雷塔斯, 托马斯·图尔兹, 奥莉安·瓦格纳·巴伦, 克劳德·卡普隆, 威廉·文森克, 弗朗索瓦·马丁, 劳伦斯·齐特沃格尔
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比较研究

CD4+CD25+调节性T细胞以转化生长因子-β依赖的方式抑制自然杀伤细胞功能

弗朗索瓦·吉林赫利等。 实验医学杂志. .

摘要

肿瘤生长促进CD4+CD25+调节性T（T reg）细胞的扩张，从而对抗T细胞介导的免疫反应。如图所示，荷瘤患者中自然杀伤（NK）细胞激活与T调节细胞扩增之间存在负相关，这促使我们研究T调节细胞在控制天然抗肿瘤免疫中的作用。我们的实验表明，人类T调节细胞表达膜结合转化生长因子（TGF）-β，该因子直接抑制NK细胞效应器功能并下调NK细胞表面的NKG2D受体。将野生型T reg细胞而非TGF-β-/-T reg细胞移植到裸鼠体内，可抑制NK细胞介导的细胞毒性，降低NKG2D受体的表达，并加速通常由NK细胞控制的肿瘤的生长。相反，小鼠T reg细胞的耗竭加剧了体内NK细胞的增殖和细胞毒性。人类NK细胞介导的肿瘤识别也可以通过去除肿瘤浸润淋巴细胞中的T调节细胞来恢复。这些发现支持T调节细胞在钝化先天免疫系统NK细胞臂中的作用。

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图1。
图1。
甲磺酸伊马替尼治疗的GIST患者的T reg细胞数量与NK细胞诱导之间的逆相关性。（A） 如前所述（参考文献20），在31例GIST患者开始使用甲磺酸伊马替尼治疗前和治疗后2个月，对异基因iDC在LPS存在下以10:1的比例刺激40小时后的NK细胞IFN-γ分泌进行前瞻性分析。使用ELISA试剂盒评估共培养中IFN-γ的积累水平。点对应于个体患者或对照。共培养标准化分析的个体内变异<10%。NK细胞诱导被定义为在2个月时，由同种异体iDC刺激的NK细胞产生的IFN-γ比基线水平（<1000 pg/ml）增加5-10倍(n个=18，NK细胞诱导；n个=13，无NK细胞诱导；和n个=13个NVs）。采用Wilcoxon双样本秩和检验对两组进行比较（*，P<0.05）。水平线表示平均值。（B） 对CD3进行FACS分析+CD4细胞+CD25型+使用抗CD3–FITC、抗CD4–PerCP和抗CD25–PE三色染色的T细胞来识别T调节细胞（CD4+CD25型高的). y轴表示CD25。高，CD4+CD25型高的T细胞；低，CD4+CD25型低的T细胞。（C） CD4细胞+CD25型高的（T调节细胞）或CD4+CD25型低的使用细胞分选仪对T细胞进行分选。同样，CD4+CD25型−或T调节细胞（CD4+CD25型+)通过磁选进行选择。这些亚群中的每一个都与体积T细胞和异基因iDC以10:10:1的比例培养。培养5天后通过测量[三H] 胸腺嘧啶掺入。这些值代表平均值±SEM。*，使用Student’s吨测试。（D） 循环CD4绝对数+CD25型高的所有GIST患者的T细胞均被归类为“NK诱导”和“非NK诱导性”，并使用FACS分析来自一组正常志愿者。数据表示为CD4绝对数的平均值±SEM+CD25型高的T细胞/mm三血腥。*，使用Student’s，P<0.05吨测试。
图2。
图2。
T调节细胞体外抑制NK细胞功能：IL-2R的拯救作用γ链依赖性细胞因子。将从GIST患者（A）或NVs（B）中纯化的NK细胞与T reg细胞或从NVs中分离的T conv细胞培养4小时，然后用51Cr标记的K562或GIST 882肿瘤靶点。T细胞/NK细胞/靶细胞的比例为10∶10∶1。铬释放试验的结果表示为三个代表性试验中一个试验的三个孔的平均值±SEM。（C） 与A和B中相同，但相对于GIST 882，T细胞/NK细胞比率可变（如图所示）。（D） 与A和B中相同，但使用在0.5%多聚甲醛中固定10分钟的T调节细胞*，在A–D中使用Fisher精确方法，P<0.05。（E） 在用IL-2或IL-12（增加剂量过夜）或500 IU/ml IL-4或10 ng/ml IL-7刺激之前，以1:1的比例将NV衍生NK细胞与T调节细胞预培养2 h。对K562的细胞溶解活性在51在没有T调节细胞的情况下，Cr释放试验是相对于NK细胞活性的残余抑制百分比。两个代表性实验中的一个实验的数据显示为三个孔的裂解抑制平均百分比±SEM。（F） NV分离的NK细胞与T reg细胞或T conv或1 ng/ml TGF-β1共同培养。培养6小时后，向共培养物中添加200 IU/ml rhuIL-2、2 ng/ml rhu IL-12或1 ng/ml IL-15。18小时后，收集上清液，并使用ELISA检测IFN-γ水平。显示了三个代表性实验中一个实验的三个重复孔的平均值±SEM。**，P<0.05。
图3。
图3。
膜结合TGF的选择性表达-β在T调节细胞上。（A） 在CD4和CD4上研究TGF-β的表达+CD25型高的与CD4相比+CD25型低的流式细胞仪中的细胞使用抗CD3–APC、抗CD4–PerCP、抗CD25–PE、抗TGF-β–FITC（AF-101-NA多克隆鸡IgY）或鸡IgY-FITC（AB-101-C）作为对照抗体进行四色染色。（B） 利用饱和浓度的重组TGF-β检测AF-101-NA多克隆鸡IgY抗体染色的特异性，这阻碍了膜结合TGF-α的检测。（C） 流式细胞术还分析了这些CD3上LAP和TGF-β-RII的表达+CD4细胞+四色染色中的T细胞亚群。
图4。
图4。
膜结合TGF的作用-βT调节细胞介导的NK细胞抑制。（A） NK细胞与T调节细胞或可溶性TGF-β1和/或TGF-51Cr标记的GIST 882肿瘤靶点。T细胞/NK细胞/靶细胞比值为10:10:1。y轴=特异性裂解K562的%。给出了三个典型实验中的一个实验结果。数值代表三个井的平均值±SEM。*，使用Fisher精确法，P<0.05。（B） NK细胞与T reg细胞孵育6小时，然后用2 ng/ml IL-12刺激18小时。收集上清液用于ELISA测定IFN-γ水平。数值表示三个重复井的平均值±SEM。显示了三个代表性实验中的一个实验的结果。*，P<0.05。（C，左）NK细胞单独培养或与T reg细胞以1:1的比例或与1 ng/ml的TGF-β1一起培养。隔夜培养后，通过三色染色流式细胞术（CD3–FITC、NKG2D–PE和CD56–PC5）对细胞进行分析。（右）与左侧面板中相同，但将T reg细胞与T conv进行比较，或添加抗TGF-β阻断抗体或IgY对照抗体与T reg电池进行比较。
图5。
图5。
裸鼠T reg细胞的过继转移。（A） 三只C57BL/6裸鼠注射PBS或2×106T调节细胞或T转换细胞间隔3天两次。第4天，在一个51以1:200靶/效应比进行Cr释放试验。值得注意的是，≤NK1.1的30%+CD3（CD3）−在第4天，所有三个实验组中的NK细胞都被回收。两个代表性实验中的一个实验的数据显示为三个脾脏的细胞溶解活性平均值±SEM.*，使用Fisher精确方法，在95%置信区间下，P<0.05。（B） 与A中相同，但使用来自TGF的T reg细胞或T conv。β−/−小鼠的E/T比为1:100（封闭栏）或1:50（开放栏）。（C） 2×106用10μg/ml抗CD3、5μg/ml抗CD28和1000 IU/ml IL-2过夜激活的T调节细胞或T转化细胞过夜转移到裸鼠体内。使用三色染色（抗CD3–PerCP、抗Dx5–FITC和抗CD62L–APC或NKG2D–PE）在24小时对脾脏进行流式细胞术分析。包括三只小鼠/组的实验进行了两次，结果相似。描述了代表性动物的点图，百分比对应于NKG2D+Dx5之间的单元格+细胞。（D） 3×105在第0天和12小时后将B16-Rae或B16-WT肿瘤细胞接种到裸鼠体内6注入活化的T reg细胞或对照（T conv或PBS）。在第25天处死小鼠以计数肺转移。学生的吨采用95%置信区间检验对两个治疗组进行比较。该图描述了两个独立实验的结果，包括五只小鼠/组。数值代表平均值±SEM。
图6。
图6。
T调节细胞缺失导致体内NK细胞深度激活。（A） 在Scurfy小鼠和WT小鼠中并行注射BrdU，以评估24h时体内基础NK细胞的增殖情况+闸门中的NK细胞CD3−/Dx5（深x 5）+用流式细胞仪四色染色法检测细胞。三个实验中有一个具有代表性，如点图所示。（B） Dx5分离后脾脏NK细胞的天然细胞毒性+在体外4小时铬释放试验中，对WT和Scurfy小鼠的细胞进行YAC-1靶点评估。该图描述了两只代表性小鼠中一只的三个微孔的平均值±SEM。*，P<0.05。（C） 在稳态和LPS或DC刺激后调节T调节细胞介导的NK细胞抑制。第7天，WT小鼠以100 mg/kg或PBS的剂量服用300μg中和抗CD25抗体（PC61）或大鼠对照Ig或CTX。第0天，小鼠脚垫注射10μg/ml LPS或3×105BM DC（GM-CSF+IL-4），同时静脉注射BrdU。图表描绘了三只动物/组中BrdU结合NK细胞百分比的平均值±SEM。（D） 5×105将RMA-S细胞单独腹腔注射于三只裸鼠（NT）或与2×10混合6从C57BL/6小鼠纯化的T调节细胞或T conv。在细胞注射后第1天、第2天和第3天收集腹腔分泌物。NK1.1的百分比+CD3（CD3）−用流式细胞仪分析渗出液中的NK细胞。该图描述了三只小鼠/组±SEM的百分比平均值。**，P<0.05。
图7。
图7。
肿瘤中T调节细胞的耗竭恢复了NK细胞对肿瘤的识别。（A） 使用三色染色（CD3–FITC、CD56–PC5和CD45–APC），通过FACS分析确定从黑色素瘤患者切除的转移性和非转移性引流淋巴结中T细胞和NK细胞的百分比。使用抗CD3–FITC、抗CD25–PE和抗CD4–PerCP单克隆抗体测定T调节细胞的百分比。显示了三个不同实验的代表性数据。（B） 来自转移性或非转移性LN的LN细胞是否耗尽CD25+或CD56+细胞以1:25的靶/效应比被自体CURA细胞或K562溶解。*，P<0.05。（C和D）分离来自两名肾癌患者的一个原发性肿瘤和一个侵袭性LN，并在Ficoll-Hypaque梯度上离心，从而分离出分别含有5.6%和9%T reg细胞以及1.8%和1.2%NK细胞的单核细胞。用涂于磁珠上的单克隆抗体抗CD56耗尽NK细胞或抗CD4单克隆抗体磁珠处理单核细胞，然后用抗CD25mAb磁珠耗尽T reg细胞，或同时用这两种磁珠耗尽NK和T reg细胞，然后与51Cr K562用于铬释放试验。细胞溶解活性在4小时内测定51铬释放试验。结果代表一个代表性实验的三重孔的平均值±SEM。
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