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.2005年9月28日；33(17):5394-403.
doi:10.1093/nar/gki863。 2005年印刷。

人类肿瘤细胞系中microRNA前体的实时表达谱

金麦江 1, 李恩珠, 尤里·古塞夫, 托马斯·施密特根
附属公司

人类肿瘤细胞系中microRNA前体的实时表达谱

金麦江等。 核酸研究. .

摘要

我们之前的研究描述了一种实时PCR方法，用于使用SYBR绿色检测定量microRNA（miRNA）前体[T.D.Schmittgen，J.Jiang，Q.Liu和L.Yang（2004）核酸研究，32，e43]。目前的研究将该分析调整为384孔格式，并将其扩展到包括222个人类miRNA前体的引物。TaqMan小沟粘结剂探针用于区分小RNA亚型let-7家族中几乎相同的成员。对来自肺癌、乳腺癌、结直肠癌、血液癌、前列腺癌、胰腺癌和头颈癌的32个人类细胞系中的miRNA前体表达进行了分析。一些miRNA前体在许多细胞系中以相似的水平表达，而其他的则有差异表达。对miRNA前体表达数据的聚类分析表明，大多数细胞系聚集在各自的组织中，每个细胞系表面上都是从这些组织中衍生出来的。在所研究的大多数条件下，PCR的miRNA前体表达与northern blotting的成熟miRNA表达相似。我们的研究提供了截至2004年12月所有已知人类miRNA前体的PCR引物序列，并提供了许多常用人类癌症细胞系中miRNA前体制表达的数据库。

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数字

图1
图1
let-7 miRNA亚型的引物和TaqMan探针序列。显示了人类let-7家族miRNA亚型成员的miRNA前体序列。带下划线的成熟miRNA序列；红色，正向PCR引物的序列；蓝色，反向PCR引物序列；TaqMan MGB探针的绿色序列；以及不同亚型之间的黄色启动序列。序列为5′至3′方向。
图2
图2
miRNA前体亚型的实时PCR。将6种miRNA前体亚型（let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7f-1、let.7f-2和let-7d）的序列克隆到质粒中。对包含每个质粒和每个亚型特异引物的七个不同反应（一式三份）进行实时PCR。每个反应都包含let-7d的TaqMan MGB探针。只有含有let-7d质粒的反应发出可检测信号(一). 实时PCR后，每个反应的一部分在琼脂糖凝胶上进行，以证明每个反应中都发生了PCR(B类). NTC，无模板控件。M、 100bp的DNA梯。
图3
图3
let-7 miRNA前体亚型的鉴别。使用基因特异性引物和TaqMan MGB探针对质粒中包含的miRNA前体基因进行实时PCR。相对检测基于CT型完全匹配和不匹配目标之间的差异。
图4
图4
癌细胞系中U6 RNA的表达。肺（橙色）、前列腺（绿色）、头颈（黄色）、乳腺（棕色）、结肠（蓝色）、造血（紫色）和胰腺（灰色）癌细胞系中U6 RNA内部控制的表达。虚线，表示U6值。
图5
图5
32个人类肿瘤细胞系中miRNA前体表达的热图。(一)图的顶部列出了32个癌细胞株的名称。图的右侧列出了癌细胞株中分析的miRNAs的名称。每个基因的相对表达通过实时PCR测定；数据以ΔC表示T型使用PCR引物对201个miRNA前体进行无监督的分级聚类。聚类前数据未经过滤。表达中值等于1的被指定为黑色；红色增加表达；绿色，表达减少；灰色，无法察觉的表情。(B类)聚类分析树状图。
图6
图6
通过northern印迹法验证成熟miRNA表达。通过northern印迹法在8个癌细胞系中验证了3个成熟miRNA和U6 RNA的表达。(一)所列八种癌细胞系中成熟miR-100、miR-21、miR-205和U6 RNA的Northern杂交。对每个RNA进行相同的印迹剥离和重新验证。(B类)成熟miRNA的密度分析（northern blot）与实时PCR测定的miRNA前体表达进行比较。
图7
图7
与组织相比，连续细胞系中组织特异性miRNAs的表达减少。先前报道miR-122a和miR-1-1/miR-133的表达分别针对肝脏和肌肉组织。(一)对从来自三个不同患者（T）、正常肝组织（N）和肝癌细胞系SK-Hep1、PLC/PRF5、SNU387和SNU449以及肺癌细胞系H719的肝细胞癌样本中分离的RNA进行miR-122a的Northern印迹。剥离印迹并重新检测U6 RNA(B类)检测横纹肌肉瘤细胞系RD2、SMS-CTR、CW9019和RH30以及正常骨骼肌组织（N）的总RNA，以检测miR-1-1、miR-133和U6 RNA。
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