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.2005年1月11日；102(2):437-42.
doi:10.1073/pnas.0408704102。 Epub 2004年12月29日。

腺苷酸环化酶的激活和过表达对心肌成纤维细胞形成和胶原合成的抑制作用

詹姆斯·斯旺尼 1, 大卫·M·罗斯, 埃里克·奥尔森, 珍妮弗·诺格尔, 加里·梅斯扎罗斯, 保罗·安塞尔
附属公司

腺苷酸环化酶激活和过度表达抑制心肌成纤维细胞形成和胶原合成

詹姆斯·斯旺尼等。 美国国家科学院程序. .

摘要

成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化是结缔组织重塑的关键事件，其特征是α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达和细胞外基质（ECM）成分的产生。在心脏等组织中需要抑制这种转化的方法，因为心脏成纤维细胞（CFs）过度产生ECM会导致纤维化、心肌僵硬和心脏功能障碍。通过免疫荧光显微镜、免疫印迹和胶原合成评估，我们测试了腺苷酸环化酶（AC）激活（cAMP水平增加）是否调节成年大鼠CF向肌成纤维细胞的转化。将CF与TGF-β或血管紧张素II孵育24小时后，α-SMA表达增加，而AC激动剂forskolin和激活蛋白激酶A的cAMP类似物可抑制α-SMA的表达。过度表达6型AC的CFs增强了forskolin促进的cAMP形成，forskolin对TGF-β刺激的α-SMA表达的抑制作用更强，并且减少了forskelin的EC（50）以减少血清刺激的胶原合成。AC刺激激动剂肾上腺髓质素抑制CF中过度表达AC6的胶原合成，但在对照组中没有。因此，交流电刺激会阻碍胶原蛋白的合成，同时也会阻碍成年大鼠CF向肌成纤维细胞的转化。AC过表达增强了这些效应，“揭示”肾上腺髓质素的抑制作用。这些发现表明，cAMP通过阻断CF向肌成纤维细胞的转化而成为ECM形成的抑制剂，并表明增加AC表达，从而通过刺激CF上表达的受体来增强cAMP的生成，可以提供一种减轻和预防心脏纤维化及其后遗症的方法。

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数字

图1。
图1。
Forskolin和CPT-cAMP钝性胶原合成成年大鼠心脏成纤维细胞。显示对胶原酶敏感[三H] 成纤维细胞在无血清培养基中生长48小时，然后用无血清培养液（对照）刺激48小时，或在不存在或存在forskolin（Fsk，10μM）、CPT-cAMP（100μM），CPT-cAMP（100µM）或肾上腺髓质素（AM，1μM）的情况下刺激2.5%(A类)或单独使用无血清培养基或在存在或不存在Fsk（10μM）的情况下使用Ang II（100 nM）或TGF-β（10 ng/ml）(B类). (C类)如上所述，培养心脏成纤维细胞并使其血清饥饿，随后在蛋白质分离前用所述试剂处理48小时（参见材料和方法用于裂解缓冲液成分）。密度测定和定量C类在pro-α1（I）带（顶带）上进行。数值表示至少四个实验的平均值±SEM，一式三份，并通过配对进行比较t吨测试编号，P（P）<0.05，针对forskolin或CPT-cAMP。
图2。
图2。
α-SMA在不同传代数CF中的表达以及对TGF-β和Ang II的反应。(A类)使用成年大鼠CF在第2-5代通过免疫印迹分析测定α-SMA的表达。第1代CFs以1:3的比例从融合单层中分离出来，并在收集全细胞裂解物之前在10%FBS存在下维持48小时。α-SMA免疫印迹后(上部)，剥离印迹并用GAPDH作为负荷控制(下部). (B类)α-SMA的表达是通过使用在10%FBS存在下保持的CF来测量的，无论有无异丁基甲基黄嘌呤（IBMX；200μM）。在对α-SMA进行免疫印迹后，将印迹剥离并用波形蛋白重制，作为负载控制，并对α-STA免疫反应带进行定量。(C类)使用CF（第2代）在无血清培养基中培养48 h，然后在无血清（对照）培养基中生长24 h，在有或无Fsk（10μM）的情况下使用Ang II（100 nM）或TGF-β（10 ng/ml）进行免疫组织化学。细胞α-SMA染色（绿色），DNA核染色（蓝色）。(D类)用免疫印迹法验证相同处理的α-SMA蛋白表达。数据表示为相对于对照的折叠变化。数值表示至少三个实验的平均值±SEM，并通过配对进行比较t吨使用事后多重比较测试进行测试和方差分析。#，P（P）与对照组相比<0.05；*,P（P）对forskolin的反应为<0.05。
图3。
图3。
AC6的过度表达增强了forskolin或肾上腺髓质素刺激的cAMP生成。使用CF在无血清培养基中生长48小时，然后仅用2.5%FBS刺激10分钟，用放射免疫法测定cAMP的生成(A插图)或在存在指定浓度的福斯科林的情况下(A类)或肾上腺髓质素(B类). 在刺激之前，将CF与表达LacZ（对照）或AC6的腺病毒孵育24小时。数值表示至少三个实验的平均值±SEM，并通过配对进行比较t吨测试和方差分析。*,P（P）与2.5%FBS相比<0.05；#，P（P）与LacZ细胞相比<0.05。
图4。
图4。
AC6的过度表达增强了forskolin和肾上腺髓质素对胶原合成的抑制作用。胶原酶敏感[三H] 用在无血清培养基中生长48小时的成年大鼠CF测定脯氨酸掺入量，然后在无血清的培养基中用2.5%FBS刺激48小时(A插图)或是否存在指定浓度的福斯科林(A类)或肾上腺髓质素(B类). 刺激前，CF与表达LacZ（对照）或AC6的腺病毒孵育24小时。数据标准化[三H] 脯氨酸并入无血清条件下生长的细胞。数值表示至少三个实验的平均值±SEM，并通过配对进行比较t吨检验和单因素方差分析。*,P（P）与2.5%FBS相比<0.05；#，P（P）与LacZ细胞相比<0.05。
图5。
图5。
AC6过表达增强了forskolin和肾上腺髓质素介导的TGF-β刺激的α-SMA表达抑制。用LacZ过表达的成年大鼠CF进行免疫组织化学(A类)或AC6(B类). CF（第2代）在无血清培养基中培养48小时，然后在无血清的培养基中单独培养24小时（对照），或在有或无forskolin（Fsk，1μM）或肾上腺髓质素（AM，0.1μM）的情况下与TGF-β（10 ng/ml）一起培养24小时。刺激前，CF与表达LacZ（对照）或AC6的腺病毒孵育24小时。在免疫组化研究中，CF被染色为α-SMA（绿色）、F-actin（指骨样蛋白，红色）、波形蛋白（红色）和DNA（DAPI，蓝色）。α-SMA和F-actin染色之间也有重叠（黄色）。(C类)免疫印迹分析验证了相同处理中α-SMA和波形蛋白的表达。定量免疫反应带；α-SMA表达标准化为波形蛋白表达。数值表示至少四个实验的平均值±SEM，并通过配对进行比较t吨测试。*,P（P）与TGF-β相比<0.05；#，P（P）与LacZ细胞相比<0.05。
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