Proapoptotic BAX and BAK regulate the type 1 inositol trisphosphate receptor and calcium leak from the endoplasmic reticulum

doi:10.1073/pnas.0408352102

.2005年1月4日；102(1):105-10.

doi:10.1073/pnas.0408352102。 Epub 2004年12月21日。

促凋亡BAX和BAK调节1型肌醇三磷酸受体和内质网钙渗漏

斯科特·奥克斯¹, 卢卡·斯科拉诺, 约瑟夫·托夫曼, 迈克尔·C·巴斯克, 马里·西野, Tullio披萨, Stanley J Korsmeyer先生

附属公司

PMID： 15613488
预防性维修识别码：第544078页
内政部： 10.1073/pnas.0408352102

促凋亡BAX和BAK调节1型肌醇三磷酸受体和内质网钙渗漏

斯科特·奥克斯等。美国国家科学院程序. 2005.

.2005年1月4日；102(1):105-10.

doi:10.1073/pnas.0408352102。 Epub 2004年12月21日。

作者

斯科特·奥克斯¹, 卢卡·斯科拉诺, 约瑟夫·托夫曼, 迈克尔·C·巴斯克, 马里·西野, Tullio披萨, Stanley J Korsmeyer先生

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院病理与医学系百翰女子医院达纳-法伯癌症研究所霍华德·休斯医学院。

PMID： 15613488
预防性维修识别码：项目经理544078
内政部： 10.1073/pnas.0408352102

摘要

促凋亡BCL-2家族成员BAX和BAK在细胞凋亡过程中启动线粒体功能障碍，并维持Ca（2+）依赖性细胞死亡所需的内质网Ca（2+）储存。相反，抗凋亡BCL-2已被证明可降低ER中的Ca（2+）浓度。我们发现Bax（-/-）Bak（-/--）双敲除（DKO）细胞由于Ca（2+）泄漏增加和肌醇三磷酸受体1（IP3R-1）Ca（2+）通透性和过度磷酸化状态的增加，降低了静息ER-Ca（2+）水平。通过减少IP3R-1的RNA干扰，DKO细胞的ER-Ca（2+）缺陷被挽救，支持了该通道调节这些细胞中增加的Ca（2+）泄漏的观点。BCL-2和IP3R-1在ER处物理相互作用，并且在没有BAX和BAK的情况下它们的结合增加。此外，敲低BCL-2可降低DKO细胞中IP3R-1磷酸化和ER-Ca（2+）泄漏率。这些发现支持了BCL-2家族成员调节IP3R-1磷酸化以控制ER-Ca（2+）从细胞内储存物泄漏速率的模型。

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数字

**图1。**
增强[Ca²⁺]_呃DKO MEF中的泄漏与IP3R-1的磷酸化增加有关。(一)erAEQ监测的代表性记录[Ca²⁺]_呃ER Ca的变化²⁺-1 mM CaCl灌注后，WT和DKO耗竭₂缓冲液和SERCA抑制剂tBuBHQ（100μM）。(B类)[加利福尼亚州²⁺]_呃用erAEQ监测WT和DKO MEF以及Ca的变化²⁺泄漏测量为[Ca的一阶导数±SE²⁺]_呃=*（f）*(t吨)添加SERCA抑制剂tBuBHQ（100μM）后；数据是从五个实验中计算出来的，并与相应的个体[Ca²⁺]_呃±SE(C类)用SDS/3–8%或4–12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离WT和DKO MEF的亚细胞组分，并对线粒体标记物Mn-superoxide dismutase（MnSOD）、IP3R-1、磷酸化丝氨酸（P-Ser）IP3R-1和磷酸化丝琳-1755 IP3R-1.进行免疫印迹。线粒体；cyt，胞浆。

**图2。**
敲低BCL-2表达降低IP3受体1型的磷酸化并增加Ca²⁺在DKO细胞中释放。(一)细胞内钙峰值²⁺浓度（[Ca²⁺]_我)根据Fura-2对转染对照（灰色条）的DKO小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的thapsigargin（Tg）（200 nM）或组胺（Hist）（100μM）的反应测定，或*Bcl-2型*（黑条）测量前24小时RNAi。(B类)转染对照组或对照组24小时后，在DKO MEFs ER组分中的总细胞裂解物或IP3R-1、磷酸化丝氨酸（P-Ser）IP3R-1和磷酸化丝琳-1755 IP3R-2中的BCL-2免疫印迹*Bcl-2型*RNAi。(C类)ER组分BCL-2免疫沉淀*Bcl-2型*^-/-、WT和DKO MEF。然后将免疫沉淀复合物转移到膜上，并用针对IP3R-1、IP3R-3、磷酸化丝氨酸-1755 IP3R-1和BCL-2的抗体进行印迹。

**图3。**
选择性击倒过度磷酸化的IP3R-1可显著恢复thapsigargin介导的Ca²⁺在DKO细胞中释放。(一)在用对照、BCL-2、IP3R-1或IP3R-3 RNAi或其组合转染24小时后，从WT MEFs制备全细胞裂解物。然后对裂解液进行IP3R-1免疫印迹(顶部)，IP3R-3(中部)和BCL-2(底部)表达式。(B类)峰值[Ca²⁺]_我在缺乏细胞外钙的情况下，根据Fura-2对组胺（100μM）的反应测定²⁺WT MEFs转染后24小时，显示RNAi序列。(C类)峰值[Ca²⁺]_我在缺乏细胞外钙的情况下，用Fura-2测定thapsigargin（200 nM）的反应²⁺WT和DKO MEFs转染后24小时，显示RNAi序列。峰值[Ca²⁺]_我与对照转染DKO细胞相比，BCL-2、IP3R-1和IP3R-1/BCL-2 RNAi转染的DKO细胞的值显著增加(*P（P）*< 0.05; 学生的t吨测试）。

**图4。**
敲除DKO细胞中BCL-2或IP3R-1导致ER-Ca降低²⁺泄漏和增加[Ca²⁺]_呃.(一)稳定状态[Ca²⁺]_呃在转染指定RNAi序列48小时后，通过erAEQ对WT和DKO MEF进行测量。[钙²⁺]_呃与对照转染的DKO细胞相比，BCL-2、IP3R-1和组合的IP3R-1/BCL-2 RNAi转染的DKO细胞的值显著增加(*P（P）*< 0.05; 学生的t吨测试）。[Ca的差异²⁺]_呃BCL-2-和IP3R-1 RNAi转染的DKO细胞之间的差异无统计学意义。(B类)[加利福尼亚州²⁺]_呃用erAEQ监测转染指定RNAi序列的WT和DKO的变化，以及Ca²⁺泄漏测量为[Ca的一阶导数±SE²⁺]_呃=*（f）*(t吨)添加tBuBHQ（100μM）后；数据是从六个实验中计算出来的，并与相应的个体[Ca²⁺]_呃±东南。

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