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.2004年12月28日；101(52):18153-8.
doi:10.1073/pnas.0405172102。 Epub 2004年12月15日。

流感病毒进入和感染需要宿主细胞N-连接糖蛋白

维克多·C·楚 1, 加里·惠塔克
附属公司

流感病毒进入和感染需要宿主细胞N-连接糖蛋白

维克多·C·楚等。 美国国家科学院程序. .

摘要

流行性感冒病毒感染的一个普遍观点是，病毒受体由细胞表面的碳水化合物唾液酸组成，它可以作为糖蛋白或糖脂存在。在这里，我们检测了流感病毒在Lec1细胞中的进入和感染，Lec1是一种突变的CHO细胞系，由于N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I（GnT1）基因突变而导致末端N-连接糖基化缺陷。我们表明，尽管流感病毒具有完全的病毒结合和融合能力，但它不能感染Lec1细胞。Lec1细胞也没有表现出病毒复制缺陷，并且在表达野生型GnT1的Lec1电池中恢复了感染。病毒明显被阻止在质膜内化的水平，并且没有被内吞。Lec1细胞对几种流感病毒株（包括甲型流感H1和H3株以及B型流感病毒）的感染不敏感。最后，从野生型CHO细胞中切割N-聚糖可显著减少流感病毒的感染。我们认为，流感病毒特别需要N-连接糖蛋白才能进入细胞，唾液酸虽然是一种有效的附着因子，但不足以作为体内流感病毒受体。

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数字

图1。
图1。
Lec1细胞未被流感病毒感染。(左侧)用流感病毒（WSN）感染CHO和Lec1细胞5h，并用抗NP抗体进行免疫荧光显微镜分析，用Hoechst染料33258对细胞核进行反染。(赖特)流式细胞术分析CHO（灰线）和Lec1（黑线）细胞。模拟感染的Lec1细胞显示为填充的浅灰色痕迹。
图2。
图2。
流感病毒与Lec1细胞结合或融合无缺陷。(一)流感病毒（WSN）在4℃下与CHO（灰线）和Lec1（黑线）细胞结合90min，并使用抗NP抗体进行流式细胞术分析。模拟处理的Lec1细胞显示为填充的浅灰色痕迹。(B类)放射性流感病毒（WSN）在4°C下与CHO和Lec1细胞结合90分钟，广泛清洗，并通过闪烁计数进行分析。细胞也用5单位/ml神经氨酸酶（NA）预处理作为对照。(C类)R18标记的流感病毒（WSN）在4°C下与CHO（灰线）和Lec1（黑线）细胞结合90分钟。将温度升高到37°C，并通过将pH降低到5.0来诱导融合。通过Triton X-100诱导完全去淬来校准融合。
图3。
图3。
Lec1细胞的流感病毒感染通过异核体或GnT1的表达得以挽救。(一)通过PEG介导Lec1和HeLa细胞融合形成异核体，感染流感病毒（WSN）5 h，然后使用抗NP抗体进行免疫荧光显微镜检查。用Hoechst染料33258对细胞核进行复染，并使用人类特异性NuMA抗体鉴定HeLa细胞核。还显示了异核体的差分干涉对比度（DIC）图像。为了定量，我们对感染的异核体中Lec1和HeLa细胞核的数量进行了评分，并与我们作为单个细胞呈现的细胞核进行了比较。显示了存在于异核体中或作为单个细胞存在的受感染的Lec1和HeLa细胞核的数量。(B类)用编码GnT1基因的质粒转染Lec1细胞。通过细胞结合FITC-标记的L-PHA凝集素的能力确认表达。使用抗NP抗体和用Hoechst染料33258复染的细胞核通过免疫荧光显微镜监测感染。
图4。
图4。
在流感病毒内化过程中，Lec1细胞被阻断感染。生物素化流感病毒在4°C时与CHO和Lec1细胞表面结合(b条和小时)90分钟，用TCEP切割表面生物素(d日和j个). 然后让细胞在TCEP治疗前内化病毒10分钟(（f）和我). 细胞通过差异干涉对比（DIC）显微镜或使用Alexa Fluor 488–链霉亲和素的免疫荧光显微镜进行分析。
图5。
图5。
用N-聚糖酶处理细胞可消除流感病毒感染。(一)用N-聚糖酶处理CHO细胞或未经处理的CHO细胞，感染流感病毒（WSN）5 h，然后用抗NP抗体进行免疫荧光显微镜分析，用Hoechst染料33258对细胞核进行复染。(B类)用流式细胞术分析N-聚糖酶处理的（黑线）和未处理的（灰线）细胞。模拟感染的Lec1细胞显示为填充的浅灰色痕迹。
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