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.2004年12月；165(6):1955-67.
doi:10.1016/s0002-9440（10）63247-6。

细胞-细胞接触的完整性是TGF-β1诱导的上皮-肌成纤维细胞转变的关键调节因子：β-catenin的作用

安德拉斯·马斯齐 1, 凌志凡, 拉兹洛·罗西瓦尔, 克里斯托弗·麦库洛赫, Ori D Rotstein公司, 伊斯特万·穆西, 安德拉斯·卡普斯
附属公司

细胞-细胞接触的完整性是TGF-β1诱导的上皮-肌成纤维细胞转变的关键调节因子：β-catenin的作用

安德拉斯·马斯齐等。 美国病理学杂志. 2004年12月.

摘要

肾小管上皮损伤和TGF-β1诱导上皮细胞转化为表达α-平滑肌肌动蛋白（SMA）的肌成纤维细胞是肾纤维化的主要特征。由于损伤破坏细胞间连接并促进纤维化，我们假设细胞接触是TGF-β1触发的上皮-间充质转化（EMT）的关键调节因子。这里我们表明TGF-β1不能在完整的融合单层中诱导EMT，但三种不同的损伤诱导的上皮完整性丧失模型（亚融合、损伤和通过去除Ca（2+）的接触性分解）恢复了其EMT诱导作用。这表现为E-钙粘蛋白的损失、纤连蛋白的产生和SMA的表达增加。TGF-β1或单独的接触拆卸只能适度刺激融合层中的SMA启动子，但共同表现出强大的协同作用。由于β-catenin是完整粘附连接的组成部分，但当从不稳定接触中释放出来时，可能会起到转录共激活剂的作用，我们研究了其在TGF-贝塔1激发的EMT中的作用。仅接触性拆卸就诱导E-cadherin和beta-catenin降解，但TGF-beta1选择性地拯救了beta-catanin并刺激了beta-catenin-driven报告子TopFLASH。此外，游离β-连环蛋白与N-钙粘蛋白细胞质尾部的螯合抑制了TGF-β1加接触分解诱导的SMA启动子激活和蛋白表达。这些结果提示了一种β-连环蛋白依赖的二次打击机制，其中EMT需要初始上皮损伤和TGF-β1。

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数字

图1
图1
细胞密度决定了TGF-β1在LLC-PK1细胞中的转化效果。答：细胞在盖玻片上生长至100%或30%汇合处，然后用载体（对照）或4 ng/ml TGF-β1处理3天。然后用抗SMA抗体（红色）和核标记DAPI对其进行染色（以验证细胞的存在）。B：细胞生长在6孔板上，直至30%或100%融合，并用载体（−）或TGF-β1（+）处理5天。等量的蛋白质进行SDS-PAGE，并通过Western blotting分析SMA、E-cadherin和纤维连接蛋白。为了测试等负荷，对膜进行微管蛋白检测。
图2
图2
损伤导致细胞间接触的丧失可恢复TGF-β1诱导EMT的能力。让细胞生长到100%汇合，然后在单层中用橡胶警察产生伤口。随后用载体处理细胞（对照组；一,C类、和E类)或4 ng/ml TGF-β1(B类,D类、和F类)3天，然后固定、渗透并染色以获得SMA(一和B类)，纤维连接蛋白(C类和D类)或β-catenin(E类和F类). 放大倍数为×40一到D类，和×100用于E类和F类.
图3
图3
低钙破坏细胞间接触，恢复融合单层中TGF-β1的转化作用。答：将汇合细胞清洗并在无血清正常或钙中培养2+-释放DMEM，3小时后用溶媒（对照）或4 ng/ml TGF-β1处理指定时间。通过Western blotting检测SMA、E-cadherin和纤维连接蛋白的表达。B：TGF-β1治疗（24小时）诱导低钙DMEM的形态学改变（相控显微镜，放大倍率，×40）。
图4
图4
汇合细胞对TGF-β1仍有反应。答：细胞在多孔组织培养插入物（孔径为3μm）上培养直至汇合，然后在正常（+）或低钙培养基（-）中去除血清。3小时后，从上部（U）或下部（L）用载体（−）或4 ng/ml TGF-β1处理细胞3天。制备总细胞裂解物，并用Western blots检测SMA的表达。B：为了测定Rho活性，将血清在正常（+）或低Ca下饥饿3小时2+（−）DMEM，然后用溶媒（−）或10 ng/ml TGF-β1（+）处理10分钟。裂解后，用GST-Rhotekin珠捕获活性Rho，并用Western blotting检测。对相同裂解物的等分样品进行总Rho的探测。抄送：用载体（对照）或4 ng/ml TGF-β1处理融合培养物。罗丹明-阴茎倍体素显示F-肌动蛋白。
图5
图5
细胞-细胞接触的次级影响或分解增强了TGF-β1对SMA启动子活性的影响。将生长至100%或30%融合的LLC-PK1细胞与pSMA-Luc（0.5μg/孔）和Renilla荧光素酶构建物（pRL-TK，0.05μg/井）联合转染。16小时后，清洗细胞并用无血清正常（+）或低钙培养2+（−）DMEM治疗4小时，然后用溶媒（–）或10 ng/ml TGF-β1（+）治疗24小时。裂解后，用光度法测定萤火虫和Renilla荧光素酶的活性。将数值标准化为在存在正常钙的情况下测量的100%融合车辆处理组的基础活性(n个= 6).
图6
图6
TGF-β1激活β-catenin-dependent TCF/LEF报告子TopFLASH。答：在6孔板上生长至30%汇合的细胞被转染TopFLASH（0.5μg/孔）或其非活性突变体FopFLASH（0.5μg/m孔）以及pRL-TK（0.05μg/井）。转染16小时后，用无血清DMEM替换培养基4小时，然后暴露于载体（对照）、10 ng/ml TGF-β1或30 mmol/L LiCl。24小时后裂解细胞，并测定荧光素酶活性。将数值归一化为TopFLASH转染对照组中测量的相对荧光素酶活性，并表示为平均值±SEM(n个= 8). 印迹显示了氯化锂处理对β-catenin稳态水平的影响。通过探测微管蛋白印迹来检测等负荷。B：用TopFLASH转染30%的融合培养物，如一用载体或10 ng/ml TGF-β1处理，并在指定的时间点进行裂解。抄送：通过转染与上述DNA混合物指示汇合处的细胞，检查细胞间接触的亚汇合或分解对TopFLASH活性的影响。16小时后，清洗细胞，并在无血清正常（+）或低钙培养基（-）中进一步培养4小时，然后用载体或10 ng/ml TGF-β1治疗。20小时后，细胞被裂解，荧光素酶活性被测定。结果表示为平均值±SEM，归一化为在正常钙培养基中30%融合液处理组中测得的活性(n个= 6).
图7
图7
TGF-β1可使β-catenin（而非E-cadherin）免于接触分解引起的降解。答：将融合的LLC-PK1细胞在无血清正常（+）或低钙（-）DMEM中培养16小时，然后用载体（-）或4 ng/ml TGF-β1（+）处理24小时。随后在Triton裂解缓冲液中对细胞进行清洗和裂解。将总细胞裂解物和Triton不溶性提取物的等分样品进行SDS-PAGE，并通过Western blotting检测粘附连接的成分。通过重制β-肌动蛋白的膜来验证等负荷。B：用载体二甲基亚砜（DMSO）或蛋白酶体抑制剂MG132（1μmol/L）处理汇合的细胞，然后在DMSO或MG132存在的正常（+）或低钙（−）培养基中孵育24小时。用Western blotting法检测总细胞裂解液中的β-连环蛋白和E-cadherin。对膜进行微管蛋白重制。抄送：如图所示，汇合细胞在正常或低钙（−）培养基中，在有或无30 mmol/L LiCl的情况下培养30分钟或24小时。随后对细胞进行裂解，并通过Western blotting检测β-catenin和tubulin（作为负荷控制）。医生：为了评估接触分解在β-catenin降解中的作用，用100μg/ml环己酰亚胺阻断融合单层中的蛋白质合成，并在有或无钙的条件下培养细胞30分钟或24小时2+注意，Ca2+-在环己酰亚胺存在下，去除强烈刺激了β-catenin的丢失，这表明它加速了β-catanin的降解。
图8
图8
β-catenin信号传导干扰抑制TGF-β1和低钙诱导的SMA启动子激活。将生长至汇合处的细胞转染pSMA-Luc（0.5μg/孔）、pRL-TK（0.05μg/井）和任一空载体（pcDNA）三，2μg/孔）或N-cad-GFP或显性负TCF4（dN-TCF4）。转染后一天，将细胞清洗并在无血清正常（+）或低钙（-）DMEM中培养4小时，然后暴露于载体（-）或10 ng/ml TGF-β1（+）中24小时。随后，测定荧光素酶的活性，并将其归一化为各组在正常钙培养基中用pcDNA转染的载体处理细胞的活性三或不同的测试质粒(n个= 6). 从每个转染组制备细胞裂解物，并用相应的抗体探测，即针对N-cad-GFP的抗GFP和针对myc标记的dN-TCF4的抗myc。治疗（TGF-β1，Ca2+-去除），在转染24小时后开始，不会影响转染构建物的表达。
图9
图9
β-catenin螯合抑制TGF-β1诱导的SMA蛋白表达。答：盖玻片上生长的细胞在用4 ng/ml TGF-β1处理前16小时，以30%的合流率单独转染GFP或N-cad-GFP（2μg/孔）。3天后，对细胞进行固定、透化和SMA染色。通过GFP阳性（GFP，底部).箭头表示相同的单元格。在未添加TGF-β1的情况下，转染GFP或N-cad-GFP的细胞中未检测到SMA表达（未显示）。B：为了量化，在三个独立的实验中，每一个实验都计算了100个GFP阳性细胞。数值为平均值±SD，P（P）< 0.02.抄送：将N-cad-GFP克隆到pFB-neo逆转录病毒（pFB-N-cad-GFP）中，感染率至少为80%。用pFB-Neo（对照）或pFB-GFP或pFB-N-cad-GFP转导30%融合处的细胞。16小时后，用载体（−）或4 ng/ml TGF-β1（+）处理细胞3天，然后裂解并检测等量的总细胞裂解物以检测SMA。对膜进行微管蛋白重制，以测试等负荷。通过密度测定法定量SMA蛋白，并将其归一化为微管蛋白水平。医生：用pFB-GFP或pFB-N-cad-GFP病毒转导生长至100%融合的细胞。16小时后，清洗细胞并在正常（+）或低钙（-）DMEM中培养。在用载体（−）或TGF-β1处理3天后，裂解细胞并测量SMA的表达。
图10
图10
氯化锂对融合培养物中TGF-β1诱导的SMA启动子激活和蛋白表达的影响。答：用pSMA-Luc和pRL-TK转染融合细胞，然后暴露于30 mmol/L NaCl（−，对照）或LiCl（+）中1小时，然后用载体或TGF-β1处理24小时。将SMA启动子活性归一化为NaCl和载体处理组(n个= 8).B：除SMA蛋白在载体或TGF-β1暴露3天后通过Western blotting测定外，融合细胞按上述方法处理。
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