Malfunction of respiratory-related neuronal activity in Na+, K+-ATPase alpha2 subunit-deficient mice is attributable to abnormal Cl- homeostasis in brainstem neurons

doi:10.1523/JNEUROSCI.2909-04.2004

.2004年11月24日；24(47):10693-701.

doi:10.1523/JNEUROSCI.2909-04.2004。

Na+，K+-ATPaseα2亚单位缺乏小鼠的呼吸相关神经元活动障碍可归因于脑干神经元的Cl-稳态异常

池田惠子¹, 小岛浩, 山田俊子, 井上光一, 上野信雅, 小中达寿司, 丰田博吉, 阿基科·阿拉塔, 石川富雄, Makoto M武藤, 福田康夫, 川崎清史

附属公司

PMID： 15564586
预防性维修识别码： PMC6730114型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.2909-04.2004

Na+，K+-ATPaseα2亚单位缺乏小鼠的呼吸相关神经元活动障碍可归因于脑干神经元的Cl-稳态异常

池田惠子等。神经科学. 2004.

.2004年11月24日；24(47):10693-701.

doi:10.1523/JNEUROSCI.2909-04.2004。

作者

池田惠子¹, 小岛浩, 山田俊子, 井上光一, 上野信雅, 小中达寿司, 丰田博吉, 阿基科·阿拉塔, 石川富雄, Makoto M Taketo先生, 福田康夫, 川崎清史

附属

¹日本藤木县川町市吉池医学院分子医学中心生物科，邮编：329-0498。

PMID： 15564586
预防性维修识别码： PMC6730114型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.2909-04.2004

摘要

Na+，K+-ATPase 2亚单位基因（Atp1a2）敲除纯合子小鼠（Atp1 a2-/-）出生后立即因呼吸困难死亡。使用脑干-脊髓整块制剂研究Atp1a2-/-的呼吸相关神经元活性。胚胎第18.5天的Atp1a2-/-胎儿第四颈腹根（C4）记录的呼吸运动神经元活性有缺陷。与野生型相比，Atp1a2-/-对电刺激延髓腹外侧区（VLM）的C4反应在Krebs溶液灌流期间恢复得更慢，这与Atp1a-/-脑内细胞外GABA高水平一致。通过光学记录观察到Atp1a2-/-的VLM缺乏抑制性神经活动。在革兰素穿孔的斑贴灯记录中检测到Atp1a2-/-的VLM神经元内的高细胞内Cl-浓度。α2亚单位和神经元特异性K-Cl协同转运蛋白KCC2在野生型胎儿的纯化突触膜部分中共同免疫沉淀。基于这些结果，我们提出了Na+、K+-ATPaseα2亚单位和KCC2之间的功能耦合模型，该模型将Cl-排除在呼吸中枢神经元的胞浆中。

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数字

**图1。**
有针对性地破坏小鼠*附件1a2.A*，针对Na突变的策略⁺，K⁺-ATP酶α2亚基基因(*附件1a2*). 外显子表示为黑盒。将一个新粘菌素耐药基因盒（neo，如白盒所示）以相反方向插入外显子2，并插入一个细菌白喉毒素亚单位基因（DTA，如灰盒所述）进行阴性选择。目标等位基因通过PCR（数据未显示）和Southern blot分析验证，所示探针位于*答：B*基因组DNA的Southern blot分析。这个*Xho公司*显示了野生型（～17 kb）和靶向（5 kb）等位基因的I DNA片段。C类RT-PCR分析从每个基因型的E18.5脑中分离的总RNA。指出了α2亚单位和β-肌动蛋白作为对照的PCR产物的位置。注意，α2亚基PCR产物在*附件1a2*^-/-小鼠（-/-）。D类，从E18.5小鼠的大脑中制备微粒体部分，并用抗α1（1:2000）、抗α2（1:1000）或抗α3（1:20000）抗体通过Western blotting分析40μg蛋白质。注意，α2亚单位多肽在*附件1a2*^-/-老鼠。

**图4。**
脑内KCC2 mRNA和蛋白的分析。一E18.5全脑KCC2表达的Northern blot分析*附件1a2*^+/+,*附件1a2*^+/-、和*附件1a2*^-/-在这些研究中，杂交了30μg总RNA。检测到的信号强度没有差异。箭头表示KCC2信号的大小为~5.3 kb。B类，使用E18.5全脑纯化突触膜部分对KCC2进行Western blotting附件1a2^+/+（1-3车道）和*附件1a2*^-/-（4-6车道）。每个通道中添加的蛋白质量为3μg（通道1、4）、10μg（路径2、5）和30μg（区域3、6）。在*Atp1a2型*^+/+和*附件1a2*^-/-在装载相同数量蛋白质的通道中。*C、现场*E18.5面细胞核KCC2 mRNA的杂交*附件1a2*^+/+和*附件1a2*^-/-.a、 b条，暗场显微照片显示KCC2 mRNA的表达*附件1a2*^-/-(b条)与*附件1a2*^+/+(一).c、 d日用硫蛋白复染的亮场显微照片显示了KCC2 mRNA杂交信号在面部运动神经元中的定位。KCC2 mRNA在*附件1a2*^+/+老鼠(*c（c）*)与*附件1a2*^-/-老鼠(d日).e、（f），感测探针在E18.5的面细胞核中没有杂交信号*附件1a2*^+/+在暗场(*e（电子）*)和光场(*（f）*)显微照片。比例尺：*a、 b、e*，200微米；*c、 d、f*，50微米。D类从野生型E18.5小鼠脑分离的突触膜中KCC2和α2亚单位的共免疫沉淀。纯化的突触膜部分用对照抗Six1（2、6道）、抗KCC2（3、7道）和抗α2（4、8道）抗体免疫沉淀。蛋白质（1.5μg）作为输入物装载在通道1或5上。印迹后，用抗KCC2（1-4道）探针检测KCC2，用抗α2（5-8道）抗体检测α2亚基。注意抗α2沉淀（第4道）中存在KCC2，抗KCC2沉淀中存在α2亚基（第7道），但对照抗体中不存在（第2、6道）。

**图2。**
脑干脊髓准备和大脑中GABA含量的记录。一，从E18.5胎儿的分离脑干脊髓制剂的颈（C4）腹根记录的灵感相关活动的示例。野生型胎儿的制剂（顶部，*附件1a2*^+/+)显示自发呼吸节律活动*附件1a2*^-/-准备（底部）。跟踪显示原始筛选和集成的活动。B类，通过脑干脊髓预备中的C4神经根记录监测对VLM的电刺激的响应。箭头表示刺激时间。在*附件1a2*^+/+，当脑干-脊髓制剂转移到*在体外*，而在同一时间点*附件1a2*^-/-。在30分钟时观察两组的反应。C4对VLM刺激反应的典型时间过程（右）。每种制剂的反应平台水平设定为100%。请注意*附件1a2*^-/-表明无自发呼吸节律活动。50%的恢复时间在*附件1a2*^-/-(n个=6）与*Atp1a2型*^+/+(n个=4），如方框所示(第页< 0.05).C类左，GABA含量显著高于*附件1a2*^-/-整个大脑比*附件1a2*^+/+和*附件1a2*^+/-大脑。对整个大脑的蛋白质含量进行标准化。GABA的平均值*附件1a2*^+/+(+/+;n个= 5),*附件1a2*^+/-(+/-;n个=8），以及*附件1a2*^-/-(-/-;n个=9）。没错，大脑灌流部分的GABA含量明显高于*附件1a2*^-/-整个大脑比*附件1a2*^+/+和*附件1a2*^+/-大脑。前20分钟灌流组分中GABA的平均总值*Atp1a2型*^+/+(+/+;n个= 6),*附件1a2*^+/-(+/-;n个=8），以及*附件1a2*^-/-(-/-;n个=9）对输入组织蛋白量进行标准化。数据为平均值±SEM。^**第页< 0.01.

**图3。**
VLM中呼吸神经元的电学和光学记录。一，代表性痕迹，显示5μ米肾上腺素（用神经元追踪上方的条形表示）对脑干脊髓制剂中C4活性的影响。C4活性出现在*附件1a2*^-/-在肾上腺素的存在下（底部）。B类左，呼吸神经元活动光学记录中的荧光变化。延髓腹面上叠加的C4峰附近呼吸神经元活动的光学图像（右迹线中的黑色垂直线处）。IX/X和XII分别是第IX/X个和第XII个颅神经根。右，在延髓的两个不同位置追踪荧光变化：蓝色，位于第IX/X颅根的正吻侧水平；红色，位于第十二颅神经的吻根水平。荧光减少（即去极化）向上，荧光增加（即超极化）向下。紫色轨迹表示C4吸气活动。C4追踪图上的淡蓝色条表示吸气阶段。从吻侧到第IX/X颅根的荧光变化（蓝色轨迹）代表野生型的超极化（顶部，*附件1a2*^+/+)纯合子的去极化（底部，*附件1a2*^-/-). 结果是由C4吸气活动触发的40-50个呼吸周期的平均值。0.05%，荧光变化校准。C类，在静息膜电位下，在电流灯模式下，格拉米西丁穿孔的斑贴灯记录。GABA（50μ米)超极化的*附件1a2*^+/+面神经核神经元（top；n个=3）但去极化*Atp1a2型*^-/-（底部；n个= 7). 显示了具有代表性的轨迹。请注意，响应GABA应用的动作电位触发*附件1a2*^-/-表明GABA的兴奋作用。使用35-100 kPa的压力脉冲施加GABA 10-50毫秒。GABA的反转电位_一-在电压灯模式下从相同的神经元获得诱发电流。D类、GABA的静息膜电位和反转电位_一接收器介导电流(E类_GABA-A公司)E18.5小鼠面部运动神经元的切片制备。静息膜电位在*附件1a2*^+/+/*Atp1a2型*^+/-（实心圆圈：-56.5±7.3 mV；n个=6）和*附件1a2*^-/-（开环；-62.8±6.1 mV；n个=8），而E类_GABA-A公司在*附件1a2*^-/-（-48.7±13.7 mV）与*附件1a2*^+/+/*附件1a2*^+/-（-64.6±5.2毫伏；第页< 0.05). GABA的驱动力_一受体介导的电流在*附件1a2*^-/-（14.0±9.6 mV）但为负*Atp1a2型*^+/+/*附件1a2*^+/-（-8.1±7.0 mV），表明GABA_一受体介导的作用在纯合子中被逆转为去极化。

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