Conditional activation of akt in adult skeletal muscle induces rapid hypertrophy

doi:10.1128/MCB.24.21.9295-9304.2004

.2004年11月；24(21):9295-304.

doi:10.1128/MCB.24.21.9295-9304.2004。

成人骨骼肌akt的条件性激活诱导快速肥大

卡曼·V·莱¹, 迈克尔·冈萨雷斯, 威廉·T·波伊米罗, 威廉·奥克莱恩, 二千那, 伊丽莎白·兹洛琴科, 特雷弗·N·斯蒂特, Aris N经济体, 乔治·D·扬科普洛斯, 大卫·J·格拉斯

附属公司

PMID： 15485899
预防性维修识别码： PMC522257
内政部： 10.1128/MCB.24.21.9295-9304.2004

成人骨骼肌akt的条件性激活诱导快速肥大

卡曼·V·莱等。分子细胞生物学. 2004年11月.

.2004年11月；24(21):9295-304.

doi:10.1128/MCB.24.21.9295-9304.2004。

作者

附属

¹Regeneron Pharmaceuticals，Inc.，777 Old Saw Mill River Rd.，Tarrytown，NY 10591-6707，USA公司。

PMID： 15485899
预防性维修识别码： PMC522257
内政部： 10.1128/MCB.24.21.9295-9304.2004

摘要

骨骼肌萎缩是一种由多种疾病引起的严重疾病，包括恶病质、癌症、艾滋病、长时间卧床休息和糖尿病。治疗萎缩的一个策略是诱导正常情况下导致骨骼肌肥大的途径。足以诱导骨骼肌肥大的途径一直存在一些争议。我们在这里描述了使用一种新的方法生产转基因小鼠，在该转基因小鼠中，组成活性形式的Akt可以在成年骨骼肌中诱导表达，从而证明Akt的急性激活足以在体内诱导快速而显著的骨骼肌肥大，伴随下游Akt/p70S6激酶蛋白合成途径的激活。在骨骼肌中诱导Akt后，脂肪组织也显著减少。这些研究结果表明，针对激活Akt的药理学方法将有助于诱导骨骼肌肥大，并且瘦肉质量的增加足以减少脂肪储存。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
转基因嵌合体（Akt）中Akt的组成激活^{Tg（千克）})结果骨骼肌肥大。（A） Akt生成策略^{Tg（千克）}动物。WT鼠标的部分地图*ROSA-26型*显示了包括外显子2（E2）在内的基因座。同源重组后，靶向载体共插入7.4 kb，包括新霉素耐药盒（NEO）、HSA启动子和与EGFP融合的组成活性形式的Akt（c.a.Akt-EGFP）*ROSA-26型*轨迹。显示了WT和目标基因座。缩写：A，AvrII；B、巴米希；RV、EcoRV；N、没有。（B）阿克特^{Tg（千克）}嵌合体表现为肥大骨骼肌表型。当我们比较Akt时，骨骼肌尺寸明显增加^{Tg（千克）}将动物交给WT的室友。双头箭头指向Akt中明显较大的肌肉^{Tg（千克）}。单箭头指向WT中Akt中不存在的胖垫^{Tg（千克）}嵌合动物。（C）转基因C.a.Akt-EGFP融合蛋白被磷酸化，并在从Akt分离的总蛋白裂解物的免疫印迹中在骨骼肌中高水平表达^{Tg（千克）}和WT肌肉。内源性Akt和c.a.Akt-EGFP融合蛋白在来自Akt的肌肉中都很明显^{Tg（千克）}，而在WT动物的肌肉中仅可见内源性Akt（上图）。c.a.Akt-EGFP蛋白在丝氨酸-473上磷酸化。在WT动物中，只有从CH模型获得的肌肉被磷酸化（下图）。Lanes（肌肉缩写）：BW，腹壁；TA，胫骨前；GA，腓肠肌；四头肌；PL，跖骨。（D）用抗层粘连蛋白抗体免疫染色的肌肉横切面，以勾勒肌肉纤维的周长。Akt的TA和MG（内侧腓肠肌）肌纤维明显增大^{Tg（千克）}但不在WT中。（E）肌肉纤维的平均横截面积。Akt的TA和MG肌纤维明显（✽）较大^{Tg（千克）}与WT相比。使用学生评估的显著性t吨测试(*P（P）*< 0.05). （F）肌纤维平均横截面积的分布。来自Akt的个人TA和MG肌纤维尺寸^{Tg（千克）}（红色条）相对于WT（灰色条）移动到曲线的右侧。

**图2。**
肌肉特异性c.a.Akt-EGFP（Akt^指数Tg)转基因小鼠的表达导致骨骼肌快速肥大。（A） Akt生成策略^指数Tg动物。他莫昔芬诱导的HSA。CreERt2.Akt公司^{Ind.总重量}通过将漂浮的Cre-ERt2和停止序列5′插入HSA-c.a.Akt-EGFP转基因构建物的c.a.Akt-EGFP，生成靶向盒（图1A）。在同源重组后，新的靶向载体将总计11 kb插入*ROSA-26型*位点（目标位点）。三苯氧胺诱导切除漂浮的Cre-ERt2盒。作为DNA重组（重组位点）的结果，c.a.Akt-EGFP盒由HSA启动子转录。（B）针对性的南方分析*ROSA-26型*轨迹。用Southern blot杂交法对AvrII消化的基因组DNA进行基因分型*ROSA-26型*轨迹。箭头表示5.3kb WT片段和8.7kb靶向Akt^{Ind.总重量}等位基因。（C）三苯氧胺诱导Akt重组的测定^指数TgSouthern blot分析等位基因。使用EGFP探针区分4.2-kb重组Akt^指数Tg靶向7.5kb的等位基因*ROSA-26型*AvrII消化基因组DNA的等位基因。仅在从三苯氧胺处理的Akt肌肉中分离的DNA中检测到重组^指数Tg老鼠。滑道（肌肉缩写）：TA，胫骨前；GA，腓肠肌；股四头肌。箭头指向4.2kb重组等位基因。（D）三苯氧胺诱导Akt重组的PCR分析^指数Tg等位基因。使用特定的寡核苷酸扩增来自Akt的473 bp PCR产物^指数Tg目标等位基因和重组位点的253-bp带（箭头）。Akt的DNA重组^指数Tg只有肌肉中的DNA（而不是尾巴中的基因组DNA）经过三苯氧胺处理后，才有明显的盒式结构。（E）三苯氧胺诱导的Akt肥大^{Ind.总重量}老鼠。脱皮WT和Akt的照片^指数Tg小鼠每天注射三苯氧胺（Tam）后1周，连续14天。诱导Akt^指数Tg小鼠的所有骨骼肌都显示出明显的尺寸差异。（F） Akt中的他莫昔芬依赖性增益^指数Tg肌肉重量。GA肌肉的肌肉重量取自未治疗（−Tam）或他莫昔芬治疗（+Tam）的WT和Akt^指数Tg老鼠。仅在Tam治疗的Akt中观察到肌肉重量的显著增加^指数Tg雄性和雌性的动物。星号表示Akt存在显著差异^指数Tg与所有其他对照组比较的重量(*P（P）*< 0.0001). 给出每组平均值的平均值±标准误差。

**图3。**
Akt骨骼肌纤维的分析^指数Tg动物。（A）通过荧光共焦显微镜比较梳理的肌纤维。高水平的EGFP与从三苯氧胺治疗的Akt的股四头肌中分离出的肌纤维增大密切相关^指数Tg小鼠（Akt^指数Tg+Tam）。三苯氧胺处理的WT（WT+Tam）小鼠未观察到EGFP荧光。（B）共聚焦显微成像对梳理肌纤维的免疫组织化学分析。一种对α-肌动蛋白（α-actinin）特异的抗体表明，从Akt股四头肌分离出的肥大纤维^指数Tg小鼠（Akt^指数Tg+Tam，右面板）保持结构完整性，正如WT（WT+Tam，左面板）中观察到的一样。（C）从三苯氧胺处理的WT（WT+Tam）、三苯氧胺处理的Akt获得的骨骼肌横截面的免疫染色^指数Tg（阿克特^指数Tg+Tam）和注油Akt^指数Tg（阿克特^指数Tg+油）老鼠。使用抗lamin抗体（顶部面板为绿色）和抗EGFP抗体（中间面板为红色）勾画肌肉纤维的边界并检测c.a.Akt。EGFP分别表达GA肌肉的纤维。切片的重叠图像显示，放大的纤维（轮廓为绿色）和c.a.Akt之间有很强的相关性。EGFP阳性纤维（红色），仅在Akt获得的横截面中观察到^指数Tg+Tam肌肉。（D）肌肉纤维的平均横截面积。从三苯氧胺处理的Akt获得的GA肌纤维^指数Tg小鼠（Akt^指数Tg+Tam）与WT肌肉或未诱导Akt相比具有更大的平均面积^指数Tg肌肉。星号表示Akt在统计上存在显著差异^指数Tg与每个对照组比较的纤维尺寸(*P（P）*< 0.0001). （E）未诱导WT和Akt的纤维尺寸分布分析^指数Tg老鼠。来自未诱导Akt的个体足底肌纤维^指数Tg（阿克特^指数Tg−Tam）小鼠（红条）的大小与未经处理的WT（WT−Tan）动物的纤维相似。（F） Akt肌纤维大小分布^指数Tg服用或不服用三苯氧胺的小鼠。三苯氧胺诱导（+Tam）Akt显著增加^指数Tg肌肉纤维大小，与未诱导Akt显示的分布相比，频率分布曲线显著向右移动（绿色条）^{Ind.总重量}肌肉（红色条）。

**图4。**
他莫昔芬诱导c.a.Akt-EGFP转基因表达和生物化学。（A）从对照（−）或三苯氧胺处理（+）WT和Akt中分离的总RNA的Northern分析^指数Tg股四头肌。这个*c.a.Akt-EGFP公司*在两个未经处理的肌肉样本（第2道和第3道）中几乎检测不到转录物，而高水平的*c.a.Akt-EGFP公司*在三苯氧胺治疗后观察到转录物（箭头指向单个3kb带，对应于*c.a.Akt-EGFP公司*成绩单）。（B）转基因c.a.Akt-EGFP融合蛋白在三苯氧胺诱导下快速产生并磷酸化。三苯氧胺诱导的c.a.Akt-EGFP表达在Akt治疗7天时显著^指数Tg股四头肌（顶部面板，7天）。在治疗14天后（顶部面板，14天）进一步诱导蛋白质水平，Akt^指数Tg在停止三苯氧胺治疗7天后（顶部面板，14+7天），该位点继续表达c.a.Akt-EGFP蛋白。这种蛋白在未经治疗的Akt中都无法检测到^指数Tg（第0天）和WT小鼠（顶部面板，通道1至4）。在所有肌肉中检测到相当数量的内源性Akt（顶面板）。诱导的c.a.Akt-EGFP蛋白在丝氨酸-473上磷酸化。在WT动物中，只有从CH模型获得的肌肉被磷酸化（底部面板）。（C） Western免疫印迹分析显示，转基因Akt-EGFP融合蛋白仅在骨骼肌中产生。用三苯氧胺治疗后，来自Akt的TA和GA肌肉中明显存在c.a.Akt-EGFP融合蛋白^指数Tg小鼠，但WT肌肉中没有。即使在三苯氧胺治疗后，肝脏中的c.a.Akt-EGFP融合蛋白也不明显。WT和Akt的肌肉中均可见内源性Akt^指数Tg动物（比较顶部面板）。用三苯氧胺处理后，诱导的c.a.Akt-EGFP蛋白在丝氨酸-473上磷酸化。在WT动物中，只有从CH模型获得的跖肌（PL）被磷酸化（底部面板）。（D）转基因Akt-EGFP融合蛋白的诱导导致内源性p70S6激酶的激活。处理（+）或对照（−）Akt的等量蛋白质提取物^指数Tg对WT股四头肌进行免疫印迹。p70S6K的磷酸特异性抗体表明，p70S6激酶仅在三苯氧胺处理的Akt中激活^指数Tg肌肉（顶部面板）。p70S6激酶的激活也通过在凝胶位移试验中监测总p70S6K蛋白来观察；上面的条带是蛋白质的磷酸化活化形式（底部面板）。

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