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.2004年2月；113(3):370-8.
doi:10.1172/JCI19670。

层粘连蛋白A/C缺乏导致核力学和机械转导缺陷

简·拉默丁 1, P克里斯蒂安·舒尔茨, Tomosaburo高桥, 塞尔盖·科兹洛夫, 特蕾莎·沙利文, 罗杰·德·卡姆, 科林·L·斯图尔特, 理查德·T·李
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拉明A/C缺陷导致有缺陷的核力学和机械传递

简·拉默丁等。 临床研究杂志. 2004年2月.

摘要

层粘连蛋白A/C基因（LMNA）突变可导致多种人类疾病，包括Emery-Dreifuss肌营养不良、扩张型心肌病和Hutchinson-Gilford早衰综合征。层粘连蛋白突变的组织特异性作用尚不清楚，部分原因是层粘连蛋白A/C的功能尚未完全确定，但许多肌肉特异性表型表明，有缺陷的层粘连蛋白A/C可能会增加细胞的机械敏感性。为了研究层粘连蛋白A/C在机械传递中的作用，我们对层粘连蛋白质A/C缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞进行机械应变，并测量核力学性质和应变诱导的信号传导。我们发现，Lmna-/-细胞增加了核变形，有缺陷的机械传递，并在机械应变下降低了生存能力。尽管转录因子结合增加，但Lmna-/-细胞中NF-kappaB调节的转录对机械或细胞因子刺激的反应减弱。因此，拉明A/C缺乏与缺陷的核力学和受损的机械激活基因转录相关。这些发现表明，在椎板病中观察到的椎板层蛋白A/C突变的组织特异性效应可能来自不同程度的核力学损伤和转录激活。

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数字

图1
图1
层粘连蛋白A/C缺乏细胞的核力学受损。(一)应变前WT成纤维细胞的细胞核（红色）和22%应变（黄色）。比例尺：10μm。(b条)Lmna–/–应变前细胞核（红色）和19%应变（黄色）。比例尺：10μm。(c（c）)核应变是外加膜应变的函数。虚线表示强制通过原点的每个单元格类型的数据的线性回归(Lmna公司+/+:年= 0.299x个,Lmna–/–:年= 0.626x个). (d日)最大归一化核应变在Lmna–/–成纤维细胞（0.306±0.029 vs.0.626±0.039；P（P）< 0.0001,n个= 21).
图2
图2
层粘连蛋白A/C缺乏细胞的细胞骨架硬度降低。(一)WT肌动蛋白应力纤维的磷脂酶染色(Lmna公司+/+)成纤维细胞。比例尺：20μm。(b条)肌动蛋白应力纤维的磷脂酶染色Lmna–/–细胞。比例尺：20μm。(c（c）)磁珠微流变学。WT（粗黑线）和Lmna–/–（粗灰色线）成纤维细胞。(d日)磁珠位移振幅在Lmna–/–成纤维细胞，表明层粘连蛋白A/C缺乏细胞的细胞骨架硬度降低（0.124±0.024μm对0.226±0.029μm；P（P）< 0.01,n个= 60). (e（电子）)细胞膜上附着有磁性（直径4.5μm）和聚苯乙烯珠（直径2μm）的成纤维细胞。比例尺：10μm。(（f）)短暂力脉冲（2.5 nN持续3秒）后位移场的图形表示。胎圈尺寸和位置按比例绘制，而胎圈偏转将放大10倍。(克和小时)角修正径向焊道位移分量的距离相关性u个第页/cosθ如方程式1所定义。虚线是方程1的最佳拟合，得出了单元刚度的估计值μ*WT的耗散κ(克)和Lmna–/–单元格(小时)分别为(μ*：27537±8458 pN/μm与2417±734.7 pN/微米；P（P）< 0.01,n个=128[重量]，153[Lmna–/–]; κ： 0.020±0.017微米–1与0.201±0.072μm–1;P（P）< 0.05,n个=128[重量]，153[Lmna–/–]). pN，微微。
图3
图3
层粘连蛋白A/C缺乏细胞的核脆性增加。(一和b条)细胞质注射后，荧光标记的70-kDa右旋糖酐被排除在细胞核之外，表明WT的核膜完整(一)和Lmna–/–(b条)细胞处于静止状态。比例尺：20μm。(c（c）)低压核注射导致WT细胞细胞核中含有荧光标记的右旋糖酐，表明注射期间核完整性得以保持。比例尺：20μm。(d日)相反，核完整性在Lmna–/–即使在低压下，也会导致荧光标记的右旋糖酐在注射过程中逃逸到细胞质中。比例尺：20μm。(e（电子）)核破裂是右旋糖酐微量注射到核内的注射压力增加的函数。零压力：在500 hPa下进行细胞质注射。低压：10–20 hPa下的核注入（**84.7%±4.24%vs.9.5%±4.53%完整核，WT和Lmna–/–细胞；P（P）< 0.0001,n个=72[重量]，42[Lmna–/–]). 中压：100–500 hPa下的核注入（WT和Lmna–/–细胞；P（P）< 0.01,n个=47[重量]，31[Lmna–/–]). 高压：1500 hPa下的核注入；所有细胞均出现核破裂。
图4
图4
层粘连蛋白A/C缺乏细胞的机械传导受损。(一)Lmna–/–成纤维细胞的碘化丙啶阳性细胞百分比显著高于WT细胞（2.88%±0.49%vs.1.14%±0.14%；P（P）< 0.01,n个=7[重量]，8[Lmna–/–])施加应变24小时后（1 Hz时为10%）。未拉伸细胞的差异不显著(n个=9[重量]，10[Lmna–/–]). (b条)FITC-结合膜联蛋白V和碘化丙啶摄取双重标记表明，凋亡（A）和坏死（N）细胞组分在Lmna–/–延长应变后的细胞。活细胞（V）为碘化丙啶阴性和FITC-阴性。左上：WT无张力控制；右上角：Lmna–/–无约束控制；左下：10%应变24小时后的WT细胞；右下角：Lmna–/–细胞在10%应变24小时后。PI，碘化丙啶。(c（c）)Lmna–/–（KO）成纤维细胞表现出弱机械诱导废气再循环-1和iex-1型应变2小时和4小时后（4%），与Lmna公司+/+单元格（WT）。GAPDH的表达没有受到负面影响。(d日)细胞因子诱导的iex-1型在年受损Lmna–/–细胞，而PMA反应性在Lmna–/–细胞。
图5
图5
层粘连蛋白A/C缺乏细胞中NF-κB信号传导缺陷。(一)核蛋白和细胞质蛋白组分的蛋白质印迹分析。细胞因子诱导的p65/RelA核移位和细胞质IκBα降解在WT和Lmna–/–成纤维细胞。以较低浓度装载细胞质蛋白。Con，控制。(b条)使用来自与一。使用未标记的竞争性和非竞争性探针确认探针特异性。NF-κB亚单位p50和p65的鉴定通过超转移试验得到证实。(c（c）)细胞因子诱导的NF-κB调节的荧光素酶活性在Lmna–/–细胞（基线百分比：282%±18.5%vs.185%±22.2%；P（P）< 0.001,n个= 9). WT和Lmna–/–细胞。
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