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.2003年11月15日；17(22):2765-76.
doi:10.1101/gad.1135503。 Epub 2003年11月4日。

Pin1调节人类RNA聚合酶II的结构和功能

徐宇欣 1, Yutaka Hirose公司, 肖振洲, Kun Ping路, 詹姆斯·曼利
附属公司

Pin1调节人类RNA聚合酶II的结构和功能

徐宇欣等。 基因开发. .

摘要

RNA聚合酶（RNAP）II最大亚单位（CTD）的C末端结构域在mRNA前体转录和形成成熟mRNA所需的加工反应中起着关键作用。CTD在转录周期中经历磷酸化的动态变化，这在协调其多种活动中起着重要作用。但这些变化本身是如何被监管的，目前尚不清楚。在这里，我们表明肽基-丙基异构酶Pin1通过抑制CTD磷酸酶FCP1和通过cdc2/cyclin B刺激CTD磷酸化来影响体外CTD的磷酸化状态。这在体内通过Pin1-/-细胞中低磷酸化RNAP II的积累反映出来，以及诱导Pin1过度表达的细胞中的一种新型超磷酸化形式。这种超高磷酸化形式的RNAP II也以Pin1依赖的方式积聚在M期细胞中，并与Pin1特异性结合。在功能上，我们发现Pin1过表达特异性抑制体内mRNA前体的持续转录，以及细胞提取物中转录和RNAP II刺激的前mRNA剪接。因此，Pin1在调节RNAP II CTD结构和功能中起着重要作用。

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数字

图1。
图1。
Pin1在体外抑制FCP1对RNAP IIO的去磷酸化。(一)本研究中使用的蛋白质。7.5%SDS-PAGE凝胶的RNAP IIA银染（lane1)和IIO（车道2)从HeLa细胞中纯化。7.5%SDS-PAGE凝胶与GST-Pin1（lane）考马斯染色三)，GST-Pin1 Y23A（车道4)和GST-Pin1 R68，69A（车道5)纯化自大肠杆菌用从重组杆状病毒感染的SF9细胞（lane）纯化的his标记的FCP1对7.5%SDS-PAGE凝胶进行考马斯染色6). 标记蛋白的大小已标明。(B类)Pin1抑制RNAP IIO去磷酸化。纯化的RNAP IIO（50 ng）与GST-Pin1（10，100，200 ng；通道三–5,7–9分别）在30°C下保持10分钟，然后添加5 ng（车道2–5)和10 ng（车道6–9)FCP1。反应混合物在30°C下培养20分钟。通过添加SDS负载缓冲液终止反应，并通过7.5%SDS-PAGE分析蛋白质。用单克隆抗体8WG16检测斑点。显示了RNAP IIA和IIO的位置。(C类)人体Pin1结构图。显示了两个Pin1突变的位置。(D类)Pin1催化结构域的突变消除了抑制作用。脱磷反应如B类带10、100或200 ng GST-Pin1（车道4–6)，GST-P11Y23A（车道7–9)或R68,69A（车道10–12). 反应混合物在30°C下孵育30分钟。用多克隆抗体N20探测印迹。
图2。
图2。
Pin1在体外通过cdc2/cyclin B刺激RNAP II磷酸化。(一)纯化的RNAP IIA（20 ng）与200 ng GST（通道4)，GST-Pin1和GST-Pin 1 R68，69A（10，100，200 ng；车道5–7,8–10在cdc2/cyclin B存在下，在30°C下保持30分钟。通过添加SDS负载缓冲液和7.5%SDS-PAGE分析的蛋白质终止反应。（车道1)HeLa全细胞提取物（5μg）。用单克隆抗体8WG16检测斑点。显示RNAP IIA和IIO的位置。(B类)反应按照一，但具有20μCi[γ-32P] ATP在30°C下保持20分钟(C类)纯化的RNAP IIO（20 ng）与GST（通道三)，Pin1和R68,69A突变型（10、100、200 ng；车道4–6,7–9然后添加10 ng cdc2/cyclin B。混合物在30℃培养30 min。通过添加SDS负载缓冲液终止反应，并通过7.5%SDS-PAGE分析蛋白质。用单克隆抗体H14检测印迹。显示RNAP IIO的位置。(D类)反应按照C类，但用单克隆抗体H5进行了检测。
图3。
图3。
Pin1增强体内RNAP II磷酸化。(一)Pin1抑制剂胡桃酮降低RNAP II磷酸化。用胡桃醌处理HeLa细胞8小时（0.05、0.125、0.625、1.25μM、lanes2–5). 用7.5%SDS-PAGE分离总细胞裂解物，并用单克隆抗体H14进行杂交(上面的)，8WG16(中间的)，和抗肌动蛋白抗体(降低). (B类)RNAP II磷酸化水平引脚1-/-MEF不受胡桃酮的影响。针脚1-/-(正确的面板）和野生型(左边面板）MEFs用胡桃酮（0.05，0.125，0.625，1.25μM，泳道2–5,7–10用7.5%SDS-PAGE分离总细胞裂解物，并用H5和H14单克隆抗体进行检测(上面的)，单克隆抗体8WG16(中间的)和抗肌动蛋白(底部). 显示RNAP IIA/O和肌动蛋白的位置。(C类)NIH 3T3细胞（lanes）总细胞裂解物的Western blot分析1,4)和针脚1-/-（车道2,5)和野生型（车道3,6)MEF，不在时（车道1–三)或存在100 ng/mL诺卡唑12小时（诺卡唑处理；车道4–6). 用7.5%SDS-PAGE分离等量（～5μg）的裂解物，并用单克隆抗体H14进行探测(上面的面板）和mAb 8WG16(降低面板）。
图4。
图4。
Pin1的诱导过表达增加了体内RNAP IIO的过度磷酸化。(一)稳定表达诱导型flu-tagged Pin1的HeLa细胞在无（lane）培养基中培养2)或存在（车道三–6)在指定的时间制备1μg/mL多西环素和总细胞裂解物。裂解液也由父母（tet-on，lane）制备1)单元格。用7.5%的SDS-PAGE对蛋白质进行分离，并用α-流感和抗Pin1抗体以及单克隆抗体H14、H5和8WG16（来自顶部到底部）。显示Flu-Pin1、Pin1、RNAP IIO和IIA。(B类)与中类似的实验一但使用可诱导表达R68、69 Pin1的细胞。
图5。
图5。
高磷酸化RNAP IIO在M期积累，并优先与Pin1结合。(一)HeLa细胞被阻滞在G1/S边界，然后释放。释放后8小时加入诺可唑，并将细胞再孵育4或6小时（Noco+，泳道9,10). G1单元（Noco+/-，车道11)通过洗涤诺科达唑处理的细胞（6小时）并在没有诺科达唑的培养基中再孵育4小时来获得。在指定的时间点，收获细胞并通过7.5%的SDS-PAGE对总细胞裂解物进行分级。用单克隆抗体8WG16检测斑点(上面的)，H14(中间的)，H5(降低)，和抗SR蛋白mAb104(底部). 显示RNAP IIO和IIA的位置。(B类)用编码Flag-epitope-tagged Pin1的表达载体转染HeLa细胞。48小时后制备细胞提取物，然后用抗Flag单克隆抗体（lane）免疫沉淀等分样品4)，抗鼠IgG（车道三)和蛋白A结合珠（lane2). 清洗颗粒，将其溶解在样品缓冲液中，并使用7.5%SDS-PAGE进行分级。用单克隆抗体8WG16和H14检测斑点(上面的)和单抗104(降低).
图6。
图6。
Pin1的诱导过表达降低体内外RNAP II转录。(一)新生多聚（A）RNA合成的脉冲标记分析。野生型和R68，69A Pin1细胞系在添加或不添加强力霉素的情况下培养指定时间。细胞暴露于[三H] 尿苷作用约10分钟。纯化总细胞RNA，并选择poly（A）RNA寡核苷酸（dT）。聚乙烯（A）+和聚（A）-RNAs被slot-blot标记，过滤器在EN3HANCE中浸泡1h并暴露于X射线胶片。(B类)聚乙烯（A）+和聚（A）-来自野生型和R68,69A细胞系的RNA一通过闪烁计数确定掺入量。车道1–4, 5–8, 9–12、和13–16分别代表不含强力霉素和含有强力霉素的细胞6、9和19小时。(C类)来自野生型的网元(正确的)和突变型R68、69A(左边)Pin1表达细胞在指定时间内接受或不接受强力霉素治疗，用于体外转录。在[α-32P] 全球贸易伙伴关系。RNA通过7M尿素-6%PAGE进行解析。显示了DNA标记的位置。预期RNA转录本为523 nt。
图7。
图7。
Pin1在体外抑制RNAP II刺激的前mRNA剪接。(一)在GST-Pin1（lanes）数量增加（10、100或200 ng）的情况下，HeLa NE中β-珠蛋白前mRNA的体外剪接2–4)或GST-Pin1 R68，69A（车道5–7). 指示了前体RNA和剪接产物的位置。(B类)NE中的剪接体形成补充了缓冲层（车道2–8)或100 ng GST-Pin1（车道9–15). 反应混合物在30°C下培养指定时间。显示了剪接复合体的位置。(C、 右)补充限制性ASF/SF2（12.5 ng；lane）的S100中β-珠蛋白前mRNA的体外剪接2)，ASF/SF2加上越来越多的纯化RNAP IIO（5、10、20 ng；车道三–5)或20 ng RNAP IIO预孵育，GST-Pin1数量增加（10、50、100 ng；车道6–8). (左侧)类似的拼接反应，但补充了50 ng ASF/SF2（车道9)加上不断增加的GST-Pin1（10、50、100 ng；车道10–12). (D类)诱导野生型NEs中β-珠蛋白前体mRNA的体外剪接(左边面板）和R68、69A(正确的面板）Pin1表达细胞系，如图6C所示。将细胞与强力霉素混合或不混合培养指定时间。RNA通过7M尿素-6%PAGE进行解析。指出了前体RNA和剪接产物的位置。
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