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.2003年8月1日；550（第3部分）：719-30。
doi:10.1113/jphysiol.2003.041863。

培养的大鼠中脑神经元在没有GABA营养支持的情况下发生超极化抑制

斯特凡·蒂茨 1, 迈克尔·汉斯, 沃尔夫冈·凯尔希, 安德烈亚·勒文, 迪特尔·斯旺杜拉, 乌尔里希·米斯盖尔德
附属公司

培养的大鼠中脑神经元在没有GABA营养支持的情况下发生超极化抑制

斯特凡·蒂茨等。 生理学杂志. .

摘要

在神经元早期发育的有限时期内，GABA会去极化并升高[Ca2+]i，从而介导GABA在神经元成熟过程中的营养作用。我们测试了一个吸引人的假设，即GABA本身促进其反应从去极化到超极化的发展变化（Ganguly等人，2001年）。在培养的中脑神经元中，我们发现GABA反应从去极化变为超极化，尽管GABAA受体在整个发育过程中被阻断。在未成熟神经元中，延长细胞暴露于纳米摩尔浓度的GABA或短暂重复应用GABA都会显著降低GABA引起的[Ca+]i升高。如禾谷镰刀菌素穿孔贴片记录所示，[Ca2+]i反应减少是由于Cl-的驱动力减弱。这表明，未成熟神经元没有有效的向内转运，无法补偿环境GABA持续激活GABAA受体导致的细胞溶质Cl损失。外部K+的瞬时增加可诱导电压依赖性Cl-进入，恢复了GABA诱导的[Ca2+]i升高。在成熟神经元中，GABA降低[Ca2+]i，前提是背景[Ca2+]i通过应用L型Ca2+通道激动剂而升高。这可能是由于Cl-电流使膜发生超极化。K（+）-Cl-共输运保持了Cl电流超极化的梯度。我们的结论是，在未成熟的中脑神经元中，尽管GABA反应是去极化的，但内向的Cl-转运是无效的。此外，在培养的中脑神经元中，GABA能反应从去极化到超极化的发育转换并不需要GABA本身。

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数字

图1
图1。GABA诱导和自发[Ca2+]我DIV 12时未成熟培养的中脑神经元数量增加
一、体细胞钙2+重复应用GABA（G，50μ米，15 s脉冲）和KCl（K20，20 m米，15 s脉冲），分别在0.3μ米TTX和20μ米DNQX公司。TTX和DNQX（*）的冲刷导致[Ca的小幅度自发升高2+]我在几个细胞中。GABA封锁后一受体介导的抑制（Bic，20μ米)，细胞显示自发同步钙2+DNQX（20μ米). 荷包牡丹碱洗脱后，同步活性停止。B类，中显示的33条记录道的平均值答：。钙2+在用HCO缓冲的溶液中记录瞬态三−插图显示了本实验中在357 nm激发的Fura-2-AM负载神经元的荧光图像；标尺，50μm。[Ca的变化2+]我表示为在两个激发波长下获得的荧光比的变化（Δ(F类357/F类380). Δ在本图和所有其他图中以任意单位给出。
图2
图2。KCl-但非GABA诱导和自发[Ca2+]我DIV 31成熟培养中脑神经元的增加
一GABA应用（G，50μ米)未能诱导Ca2+KCl（K20，20 m）时的瞬态米)诱导响应具有与图1所示类似的特性。在0.3μ米TTX和20μ米DNQX公司。TTX和DNQX（*）的冲刷导致[Ca的小幅度自发升高2+]我在所有单元格中。GABA封锁一荷包牡丹碱受体（Bic，20μ米)导致同步钙2+振动频率和振幅高于DIV 12（图1）。钙2+DNQX（20μ米).B类，顶部面板中显示的10条记录道的平均值。钙2+在用HCO缓冲的溶液中记录瞬态三−插图显示了本实验中在357 nm激发的Fura-2-AM负载神经元的荧光图像；标尺，50μm。
图3
图3。GABA慢性阻断一受体不能阻止GABA反应的发育变化
一，自发GABA一DIV 8发育中神经元的受体介导钙瞬变。大多数神经元没有自发钙离子2+短暂（底部痕迹），但一些神经元显示荷包牡丹碱敏感（顶部痕迹）钙2+信号。此外，我们还观察到荷包牡丹碱和DNQX均不敏感的信号。B类，在保持电位下记录发育中神经元（DIV 7）的自发突触电流(V（V）H（H）)自发IPSC和EPSC分别为外向电流和内向电流。应用AMPA受体阻滞剂DNQX可逆地消除了所有突触活动，表明在这个发育阶段，大多数GABA能神经元在缺乏兴奋性驱动的情况下不会自发活动。C类，对照培养物（Con）和慢性治疗培养物（BPTTX:20μ米荷包牡丹碱，20μ米苦毒毒素，0.3μ米TTX）。GABA/甘氨酸钙2+信号除以20 m的平均值米氯化钾诱导钙2+信号（控制590±8，n个=401678个细胞；BPTTX 1322±16，n个=11907个单元格）。在DIV 9之前，对照组的反应基本保持不变。因此，将比率标准化为DIV≤9时的值，并根据培养年龄绘制(n个=1-12个培养基，共51个）。插图显示，神经元（a列和b列）与K的相对丰度+–氯−斑贴灯记录显示，共转运活性与培养时间平行增加（Kelsch等。2001). GABA/甘氨酸反应图中的水平条a和b表示对具有和不具有转运活性的神经元进行采样的时间。图中的每个点和插图中的列都会显示单元格数。D类，平均Ca2+甘氨酸和KCl以及三种BPTTX处理的DIV 10培养物中自发活动诱导的信号。左侧面板，三种不同培养物对甘氨酸的反应（0.5 m米)和KCl（20米米)在荷包牡丹碱、DNQX和TTX的存在下。在这些条件下，未观察到自发的钙瞬变（右，中迹线，平均135个细胞）。神经元显示自发同步钙2+去除拮抗剂后的振荡（右下轨迹，平均79个细胞）。这些振荡在荷包牡丹碱的存在下增强（右上图，平均79个细胞）。
图4
图4。[钙2+]我L型钙存在时甘氨酸反应减少2+通道激动剂FPL 64176
一，荧光比率图像(F类357/F类380)典型[Ca2+]我在第一次施用甘氨酸（Gly/con）期间，在施用20 m米KCl（KCl），添加FPL 64176（FPL，1μ米)在第一次在FPL（Gly/FPL）存在下施用甘氨酸期间和甘氨酸脉冲后（清洗）。校准棒：50μm；强度越高表示Ca越高2+]我.B类，[Ca的平均值2+]我对甘氨酸或KCl应用的反应（Gly，0.5 m米; K20，20米米; 15 s脉冲，63个细胞），从所示培养物中获得一在控制条件下(地下一层)在1μ米FPL公司(地下二层). 注意基底标高[Ca2+]我通过FPL可以监测甘氨酸诱导的[Ca2+]我减少，尽管这些细胞已被GABA长期治疗一受体拮抗剂和TTX。相同的校准地下一层和地下二层在Hepes缓冲液中监测所有细胞。
图5
图5。[钙2+]我高程和Cl−电流对GABA和甘氨酸的反应
一在DIV 8联合使用革兰菌素穿孔贴片记录和钙成像。Cl的振幅−通过穿孔贴片记录（顶部迹线，V（V）H（H）=−60 mV）和同时记录的Ca2+随着重复应用GABA（50μ米，15 s脉冲）。B类在DIV 13结合全细胞斑块记录和钙成像。全细胞补丁记录的电流响应幅度（顶部记录道，V（V）H（H）=−75 mV）在重复应用GABA（50μ米，15 s脉冲）。相比之下，Ca2+平行记录的瞬态（底部轨迹，平均15个细胞）下降。C类，Ca平均值2+交替使用GABA和甘氨酸（50μ米和500μ米分别为15 s脉冲，12个细胞）。D类，纳米摩尔浓度的GABA足以减少甘氨酸引起的钙2+瞬态。在两次甘氨酸应用之间，将BPTTX培养的培养物（DIV 9–13）以低GABA浓度（0.1–3μ米). 根据GABA浓度绘制第二（Gly2）和第一（Gly1）甘氨酸反应振幅之间的比值。插图显示对照组的平均反应(n个= 17), 0.3 μ米GABA公司(n个=35）和0.5μ米GABA公司(n个= 23). 为每个点指示的单元格数。
图6
图6。长时间去极化可恢复未成熟神经元的GABA反应，但仅短暂降低成熟神经元的γ-氨基丁酸反应
一，平均（7个细胞）GABA诱导的Ca2+显示了DIV 10处细胞的响应。重复应用GABA（G，50μ米，15 s脉冲）[Ca2+]我反应减少。海拔[K后+]o个（水平杆，K20，20米米，8分钟）GABA诱导的[Ca2+]我随着GABA申请的增加，回复再次增加，再次下降。第二次下降被第二次升高[K所逆转+]o个（5分钟）。B类，[Ca的还原2+]我重复GABA应用引起的信号可以通过[K的中间升高来反转+]o个（K20，8分钟，阴影条），但不需要15分钟的清洗期（15′，开放条）。在控制条件下（Con，填充棒，n个= 6). 两次用药之间15分钟的洗脱期并没有恢复反应（15′，开杆，n个= 4). 然而，海拔[K+]o个至20米米（K20，8分钟，n个=9）GABA应用之间导致以下响应增加。C类，平均（13个细胞）甘氨酸诱导的[Ca2+]我DIV 29处的单元格显示响应。重复应用甘氨酸（Gly）诱导[Ca的瞬时降低2+]我.[K的瞬态高程+]o个（K20，3-5分钟）导致甘氨酸诱导的Ca减少2+尽管重复使用甘氨酸，但仍能恢复信号。在这个实验中，GABA一荷包牡丹碱（20μ米).
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