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.2003年5月15日；22(10):2443-52.
doi:10.1093/emboj/cdg225。

ZEB蛋白在TGFbeta/BMP信号通路调控中的反作用

安东尼奥·波西戈 1
附属公司

ZEB蛋白在TGFbeta/BMP信号通路调控中的反作用

安东尼奥·波西戈. 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

TGFβ/BMP因子与其受体的结合导致Smad蛋白易位到细胞核，在那里它们激活靶基因的转录。Zfhx1a和Zfhx1b、ZEB-1/deltaEF1和ZEB-2/SIP1分别编码的双手锌指蛋白调节许多组织中的基因表达和分化程序。在这里，我证明了ZEB蛋白也是TGFbeta/BMP信号传导的关键调节器，对该途径具有相反的作用。两种ZEB蛋白都与Smad结合，但当ZEB-1/deltaEF1与Smad蛋白协同激活转录、促进成骨细胞分化和诱导细胞生长停滞时，高度相关的ZEB-2/SIP1蛋白具有相反的作用。最后，TGFβ介导TGFβ依赖性基因转录和诱导生长停滞的能力取决于内源性ZEB-1/detaEF1蛋白的存在。

PubMed免责声明

数字

无
图1。(一)双手锌指因子的ZEB族（ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1）示意图。两个锌指簇之间的中央区域（CR）部分通过CID招募CtBP辅阻遏物发挥阻遏作用。在N端锌指的3′处，有一个区域充当SID。（B、C和D）ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1绑定到激活的R-Smads。293T细胞与所示表达载体共转染：3µg标记的Smad1、Smad2或Smad3、4µg myc标记的全长人ZEB-1/δEF1或ZEB-2/SIP1以及0.8µg对应的组成活性血凝素标记的组成活性ALKs ALK6（Q203D）用于Smad1(B类)和用于Smad2和Smad3的ALK5（T204D）(C类和D类). 48 h后，对Flag-Smads的细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并用9E10-myc抗体进行免疫印迹（WB）检测共免疫沉淀ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1。输入代表15%的裂解物。
无
图1。(一)双手锌指因子ZEB族（ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1）的示意图。两个锌指簇之间的中央区域（CR）部分通过CID招募CtBP辅阻遏物发挥阻遏作用。在N端锌指的3′处，有一个区域充当SID。（B、C和D）ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1绑定到激活的R-Smads。293T细胞与所示表达载体共转染：3µg标记的Smad1、Smad2或Smad3、4µg myc标记的全长人ZEB-1/δEF1或ZEB-2/SIP1以及0.8µg对应的组成活性血凝素标记的组成活性ALKs ALK6（Q203D）用于Smad1(B类)Smad2和Smad3的ALK5（T204D）(C类和D类). 48 h后，对Flag-Smads的细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并用9E10-myc抗体进行免疫印迹（WB）检测共免疫沉淀ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1。输入代表15%的裂解物。
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图1。(一)双手锌指因子的ZEB族（ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1）示意图。两个锌指簇之间的中央区域（CR）部分通过CID招募CtBP辅阻遏物发挥阻遏作用。在N端锌指的3′处，有一个区域充当SID。（B、C和D）ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1绑定到激活的R-Smads。293T细胞与所示表达载体共转染：3µg标记的Smad1、Smad2或Smad3、4µg myc标记的全长人ZEB-1/δEF1或ZEB-2/SIP1以及0.8µg对应的组成活性血凝素标记的组成活性ALKs ALK6（Q203D）用于Smad1(B类)Smad2和Smad3的ALK5（T204D）(C类和D类). 48 h后，对Flag-Smads的细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并用9E10-myc抗体进行免疫印迹（WB）检测共免疫沉淀ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1。输入代表15%的裂解物。
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图1。(一)双手锌指因子的ZEB族（ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1）示意图。两个锌指簇之间的中心区（CR）部分通过CID募集CtBP共阻遏物而起阻遏物结构域的作用。在N端锌指的3′处，有一个区域充当SID。（B、C和D）ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1绑定到激活的R-Smads。293T细胞与所示表达载体共转染：3µg标记的Smad1、Smad2或Smad3、4µg myc标记的全长人ZEB-1/δEF1或ZEB-2/SIP1以及0.8µg对应的组成活性血凝素标记的组成活性ALKs ALK6（Q203D）用于Smad1(B类)和用于Smad2和Smad3的ALK5（T204D）(C类和D类). 48 h后，对Flag-Smads的细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并用9E10-myc抗体进行免疫印迹（WB）检测共免疫沉淀ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1。输入代表15%的裂解物。
无
图2。(一–C类)ZEB蛋白与Smad1、Smad2和Smad3的相互作用需要TGFβ信号。实验如图1B-D所示，但没有相应的组成活性ALKs ALK5（T204D）和ALK6（Q203D）。(D类)内源性ZEB-1/δEF1与Smad2和Smad3之间的相互作用。在存在或不存在20µg ALK5表达载体（T204D）的情况下，用ZEB-1/δEF1抗体或对照抗体（goat-Ig）免疫沉淀293T细胞的细胞裂解物。然后对ZEB-1/δEF1免疫沉淀的蛋白质进行相关内源性Smad2和Smad3的蛋白质印迹。NS表示非特异性带。(E类)ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1（Smad-interacting region，SID）中的相同区域调节它们与激活的Smad1和Smad3的结合。分别在组分活性ALK6（Q203D）和ALK5（T204D）存在的情况下，测试ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1的指示myc标记结构（更多详细信息，请参阅材料和方法）与Smad1和Smad3相互作用的能力。
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图2。(一–C类)ZEB蛋白与Smad1、Smad2和Smad3的相互作用需要TGFβ信号。实验如图1B-D所示，但没有相应的组成活性ALKs ALK5（T204D）和ALK6（Q203D）。(D类)内源性ZEB-1/δEF1与Smad2和Smad3之间的相互作用。在存在或不存在20µg ALK5表达载体（T204D）的情况下，用ZEB-1/δEF1抗体或对照抗体（goat-Ig）免疫沉淀293T细胞的细胞裂解物。然后对ZEB-1/δEF1免疫沉淀的蛋白质进行免疫印迹，以检测相关内源性Smad2和Smad3。NS表示非特异性带。(E类)ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1（Smad-interacting region，SID）中的相同区域调节它们与激活的Smad1和Smad3的结合。分别在组分活性ALK6（Q203D）和ALK5（T204D）存在的情况下，测试ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1的指示myc标记结构（更多详细信息，请参阅材料和方法）与Smad1和Smad3相互作用的能力。
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图2。(一–C类)ZEB蛋白与Smad1、Smad2和Smad3的相互作用需要TGFβ信号。实验如图1B-D所示，但没有相应的组成活性ALKs ALK5（T204D）和ALK6（Q203D）。(D类)内源性ZEB-1/δEF1与Smad2和Smad3之间的相互作用。在存在或不存在20µg ALK5表达载体（T204D）的情况下，用ZEB-1/δEF1抗体或对照抗体（goat-Ig）免疫沉淀293T细胞的细胞裂解物。然后对ZEB-1/δEF1免疫沉淀的蛋白质进行免疫印迹，以检测相关内源性Smad2和Smad3。NS表示非特异性带。(E类)ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1（Smad-interacting region，SID）中的相同区域调节它们与激活的Smad1和Smad3的结合。分别在组分活性ALK6（Q203D）和ALK5（T204D）存在的情况下，测试ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1的指示myc标记结构（更多详细信息，请参阅材料和方法）与Smad1和Smad3相互作用的能力。
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图2。(一–C类)ZEB蛋白与Smad1、Smad2和Smad3的相互作用需要TGFβ信号。实验如图1B-D所示，但没有相应的组成活性ALKs ALK5（T204D）和ALK6（Q203D）。(D类)内源性ZEB-1/δEF1与Smad2和Smad3之间的相互作用。在存在或不存在20µg ALK5表达载体（T204D）的情况下，用针对ZEB-1/δEF1的抗体或对照抗体（山羊Ig）免疫沉淀的293T细胞的细胞裂解物。然后对ZEB-1/δEF1免疫沉淀的蛋白质进行免疫印迹，以检测相关内源性Smad2和Smad3。NS表示非特异性带。(E类)ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1（Smad-interacting region，SID）中的相同区域调节它们与激活的Smad1和Smad3的结合。测试了ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1的myc标记构建体（更多细节见材料和方法）分别在组成型活性ALK6（Q203D）和ALK5（T204D）存在下与Smad1和Smad3相互作用的能力。
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图2。(一–C类)ZEB蛋白与Smad1、Smad2和Smad3的相互作用需要TGFβ信号。实验如图1B-D所示，但没有相应的组成活性ALKs ALK5（T204D）和ALK6（Q203D）。(D类)内源性ZEB-1/δEF1与Smad2和Smad3之间的相互作用。在存在或不存在20µg ALK5表达载体（T204D）的情况下，用ZEB-1/δEF1抗体或对照抗体（goat-Ig）免疫沉淀293T细胞的细胞裂解物。然后对ZEB-1/δEF1免疫沉淀的蛋白质进行免疫印迹，以检测相关内源性Smad2和Smad3。NS表示非特异性条带。(E类)ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1中的相同区域（Smad相互作用区，SID）介导它们与活化的Smad1和Smad3的结合。分别在组分活性ALK6（Q203D）和ALK5（T204D）存在的情况下，测试ZEB-1/δEF1和ZEB-2/SIP1的指示myc标记结构（更多详细信息，请参阅材料和方法）与Smad1和Smad3相互作用的能力。
无
图3。ZEB-1/δEF1与TGFβ/BMP在转录激活中协同作用，而ZEB-2/SIP1则抑制。(一和B类)Mv1Lu或HaCAT细胞（在这两种细胞类型中都获得了类似的结果）与0.3µg萤火虫荧光素酶报告子共同转染，该报告子含有指示的启动子以及0.48µg空载体（CS2MT，未显示）或0.7µg ZEB-1/δEF1或ZEB-2/SIP1表达载体，并用TGFβ1刺激（Mv1Lu为25 pM，HaCAT为100 pM）。(C类)用含有BMP-2反应性Xvent2启动子的萤火虫荧光素酶报告子转染C2C12细胞，如（A）和（B）所示。如有指示，用100 ng/ml BMP-2处理细胞。(D类)ZEB蛋白对TGFβ介导的转录的调节依赖于R-Smads的转录活性，需要SID。向Mv1Lu或HaCAT细胞转染0.3µg 3TPluc和0.48µg载体（CS2MT，未显示）、0.6µg ZEB-1（ΔSID）或ZEB-2（△SID）（缺少SID）或者0.7µc全长ZEB-1或ZEB-2。如有指示，共转染Smad3显性阴性表达载体（Smad3-DN，D470E）。(E类和F类)ZEB蛋白调节TGFβ介导的转录需要Smad4的存在。Smad4（+/+）HCT 116细胞（E）和Smad 4（–/–）HCT 115/518细胞（F）与3TP-luc、ZEB-1或ZEB-2和ALK5（T204D）共同转染，以激活TGFβ信号通路。
无
图3。ZEB-1/δEF1与TGFβ/BMP在转录激活中协同作用，而ZEB-2/SIP1则抑制。(一和B类)Mv1Lu或HaCAT细胞（在这两种细胞类型中都获得了类似的结果）与0.3µg萤火虫荧光素酶报告子共同转染，该报告子含有指示的启动子以及0.48µg空载体（CS2MT，未显示）或0.7µg ZEB-1/δEF1或ZEB-2/SIP1表达载体，并用TGFβ1刺激（Mv1Lu为25 pM，HaCAT为100 pM）。(C类)用含有BMP-2反应性Xvent2启动子的萤火虫荧光素酶报告子转染C2C12细胞，如（A）和（B）所示。如有指示，用100 ng/ml BMP-2处理细胞。(D类)ZEB蛋白对TGFβ介导的转录的调节依赖于R-Smads的转录活性，需要SID。向Mv1Lu或HaCAT细胞转染0.3µg 3TPluc和0.48µg载体（CS2MT，未显示）、0.6µg ZEB-1（ΔSID）或ZEB-2（△SID）（缺少SID）或者0.7µc全长ZEB-1或ZEB-2。如有指示，共转染Smad3显性阴性表达载体（Smad3-DN，D470E）。(E类和F类)ZEB蛋白调节TGFβ介导的转录需要Smad4的存在。Smad4（+/+）HCT 116细胞（E）和Smad 4（–/–）HCT 115/518细胞（F）与3TP-luc、ZEB-1或ZEB-2和ALK5（T204D）共同转染，以激活TGFβ信号通路。
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图3。ZEB-1/δEF1与TGFβ/BMP在转录激活中协同作用，而ZEB-2/SIP1则抑制。(一和B类)Mv1Lu或HaCAT细胞（在这两种细胞类型中都获得了类似的结果）与0.3µg萤火虫荧光素酶报告子共同转染，该报告子含有指示的启动子以及0.48µg空载体（CS2MT，未显示）或0.7µg ZEB-1/δEF1或ZEB-2/SIP1表达载体，并用TGFβ1刺激（Mv1Lu为25 pM，HaCAT为100 pM）。(C类)用含有BMP-2反应性Xvent2启动子的萤火虫荧光素酶报告子转染C2C12细胞，如（A）和（B）所示。如有指示，用100 ng/ml BMP-2处理细胞。(D类)ZEB蛋白对TGFβ介导的转录的调节依赖于R-Smads的转录活性，需要SID。向Mv1Lu或HaCAT细胞转染0.3µg 3TPluc和0.48µg载体（CS2MT，未显示）、0.6µg ZEB-1（ΔSID）或ZEB-2（△SID）（缺少SID）或者0.7µc全长ZEB-1或ZEB-2。如有指示，共转染Smad3显性阴性表达载体（Smad3-DN，D470E）。(E类和F类)ZEB蛋白调节TGFβ介导的转录需要Smad4的存在。Smad4（+/+）HCT 116细胞（E）和Smad 4（–/–）HCT 115/518细胞（F）与3TP-luc、ZEB-1或ZEB-2和ALK5（T204D）共同转染，以激活TGFβ信号通路。
无
图4。ZEB-1/δEF1增强间充质细胞依赖BMP-2的成骨分化。C2C12与8µg单独载体（CS2MT）或ZEB-1、ZEB-2或其ΔSID缺失突变体（ZEB-1△SID和ZEB2△SID）表达载体共转染，并用指定量的BMP-2处理。4天后，按照材料和方法中的描述，评估细胞的碱性磷酸酶活性。
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图5。ZEB-1/δEF1协同TGFβ介导G1细胞周期阻滞。(一)用20µg空载体或ZEB-1/δEF1以及1µg EGFP表达载体（作为筛选转染细胞的标记物）转染Mv1Lu细胞，如有指示，用18 pM（次优剂量）或75 pM（最大生长抑制剂量）TGFβ1处理。用流式细胞仪分析EGFP阳性细胞的细胞周期。(B类)如（A）所示，但细胞与75 ng/ml诺卡唑预孵育48 h，以诱导G2/M逮捕（参见材料和方法以及张等., 2000). (C类)将20µg的空载体、全长ZEB-1/δEF1或缺失SID（ZEB-1/dδEF1ΔSID）和EGFP的ZEB-1/DΔEF1突变体转染Mv1Lu细胞，如（B）所示。G中的细胞百分比1相由FACS测定，并比较TGFβ1（亚最佳剂量和最大有效剂量）的存在与否。
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图5。ZEB-1/δEF1协同TGFβ介导G1细胞周期阻滞。(一)用20µg空载体或ZEB-1/δEF1以及1µg EGFP表达载体（作为筛选转染细胞的标记物）转染Mv1Lu细胞，如有指示，用18 pM（次优剂量）或75 pM（最大生长抑制剂量）TGFβ1处理。通过FACS分析分析EGFP阳性细胞的细胞周期谱。(B类)如（A）所示，但细胞与75 ng/ml诺卡唑预孵育48 h，以诱导G2/M逮捕（参见材料和方法以及张等., 2000). (C类)将20µg的空载体、全长ZEB-1/δEF1或缺失SID（ZEB-1/dδEF1ΔSID）和EGFP的ZEB-1/DΔEF1突变体转染Mv1Lu细胞，如（B）所示。G中的细胞百分比1相由FACS测定，并比较TGFβ1（亚最佳剂量和最大有效剂量）的存在与否。
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图5。ZEB-1/δEF1协同TGFβ介导G1细胞周期阻滞。(一)用20µg空载体或ZEB-1/δEF1以及1µg EGFP表达载体（作为筛选转染细胞的标记物）转染Mv1Lu细胞，如有指示，用18 pM（次优剂量）或75 pM（最大生长抑制剂量）TGFβ1处理。用流式细胞仪分析EGFP阳性细胞的细胞周期。(B类)如（A）所示，但细胞与75 ng/ml诺卡唑预孵育48 h，以诱导G2/M逮捕（参见材料和方法以及张等., 2000). (C类)将20µg的空载体、全长ZEB-1/δEF1或缺失SID（ZEB-1/dδEF1ΔSID）和EGFP的ZEB-1/DΔEF1突变体转染Mv1Lu细胞，如（B）所示。G中的细胞百分比1相由FACS测定，并比较TGFβ1（亚最佳剂量和最大有效剂量）的存在与否。
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图6。ZEB蛋白调节TGFβ依赖性生长抑制。用空载体ZEB-1/δEF1或ZEB-2/SIP1稳定转染Mv1Lu细胞。用不同剂量的转化生长因子β1处理稳定克隆，并通过测量其细胞增殖[三H] 胸苷摄取。显示了每个构造的两个代表性克隆。
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图7。内源性ZEB/δEF1介导TGFβ的功能。(一)内源性ZEB/δEF1对TGFβ依赖性转录激活很重要。将0.3µg TGFβ应答3TP启动子转染Mv1Lu细胞，并按照图3评估转录活性。如有指示，添加ZEB-1/δEF1反义寡核苷酸（寡核苷酸ZEB1）或加扰对照寡核苷酸（少核苷酸对照）（见材料和方法）。共转染1/微克SV40βgal以控制转染效率。(B类)内源性ZEB/δEF1对TGFβ介导的生长抑制很重要。用反义寡核苷酸和0.2µg puroBabe转染Mv1Lu细胞，并用1 mg/ml嘌呤霉素和20 pM TGFβ1处理36 h，然后通过掺入[三H] 胸腺嘧啶。
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