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.2002年11月；13(11):4013-28.
doi:10.1091/mbc.02-03-0046。

蛋白激酶MARK/PAR-1是神经突起生长和建立神经元极性所必需的

杰克·比尔纳 1, 吴永中, 托马斯·蒂姆, 庆义正发, 埃克哈德·曼德尔科夫, 劳伦特·梅杰尔, 伊娃·玛丽亚·曼德尔科夫
附属公司

蛋白激酶MARK/PAR-1是神经突起生长和建立神经元极性所必需的

杰克·比尔纳等。 分子生物学细胞. 2002年11月.

摘要

微管亲和调节激酶（MARK）家族的蛋白激酶最初被发现是因为它们能够磷酸化τ蛋白中的某些位点（重复域中的KXGS基序）。这种磷酸化在阿尔茨海默病脑组织异常tau中增强，导致tau从微管中脱落。MARK相关激酶（PAR-1和KIN1）存在于各种生物体中，参与建立和维持细胞极性。在此，我们报告了MARK2影响神经母细胞瘤和其他细胞模型细胞进程的分化和生长的能力。MARK2在KXGS基序处磷酸化tau蛋白；这导致tau从微管中分离并破坏其稳定性。如果通过转染显性阴性突变体或通过MARK2抑制剂（如处女膜下注射抑制剂）使MARK1失活，则N2a细胞中神经突起的形成被阻断。或者，如果tau上的靶KXGS基序通过点突变变得不可磷酸化，则神经突被阻断。结果表明，MARK2有助于神经元极性和轴突生长所需微管的可塑性。

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数字

图1
图1
人类tau、磷酸化位点和抗体表位的条形图。（a） N末端的一半是“投影域”，因为它从微管表面投影，但不绑定自身。C末端的一半是“组装域”，因为它与微管结合并促进其组装。结合由三到四个假重复序列（每个约31个残基）和侧翼结构域（阴影）介导。与CNS中最长的亚型（htau40441个残基）相比，胎儿亚型htau23（352个残基。标记SP或TP基序（重复域外，htau23中14，htau40中17）；在AP-htau23突变体中，S或T残基被A取代，因此它们不能被脯氨酸导向激酶磷酸化。KXGS图案（每个重复一个）是MARK的目标；在KXGA-htau23突变体中，S残基被A取代，使其不可磷酸化。（b） 指出htau40中对磷酸化敏感的抗体表位。cdk5或cdc2在htau40上的主要靶点是双基序T231/S235（抗体AT-180的表位）、S202/T205（抗体AT-8）和S404（仅与PHF-1反应微弱）；GSK-3β的主要靶点是S396/S404（与PHF-1抗体的强反应）和S202/T205（AT-8表位）（Illenberger等。, 1998); MARK的主要靶点是S262（抗体12E8的表位）。
图2
图2
神经母细胞由N2a细胞生长并依赖tau磷酸化。通过血清提取和维甲酸对N2a细胞进行分化，然后瞬时转染tau或tau突变体，并对长于两个细胞体直径（>40μm）的延伸神经突起的发育进行评分。（a和c）Tau染色（抗体K9JA）。（b和d）微管蛋白染色（DM1A）。（a和b）用htau23瞬时转染细胞（效率50%）。在不表达外源性tau的细胞中，只有20%的细胞发育出延伸的轴突（对照；图2e）。相反，在表达外源性htau23的细胞中，具有延伸轴突的细胞比例上升至60%（图2，a和b，箭头和f）。（c和d）转染htau23的KXGA突变的细胞：在表达外源性tau突变的细胞中（2、c和d中箭头所示的三个细胞），只有少数细胞的轴突长于两个细胞体直径（与d中其他未转染细胞相比）。这表明KXGS基序的磷酸化对神经突起的生长很重要。（e） 分化对照N2a细胞（无tau转染）。（f） 不同tau结构的突起形成直方图：只有20%的对照细胞显示延伸的突起，但转染htau23的细胞有60%。转染htau23的KXGA突变体的细胞与对照细胞相当（20%，MARK2可能没有磷酸化）。转染AP突变体的细胞与转染htau23的细胞相当（60%，脯氨酸导向激酶无磷酸化）。数据显示，用htau23和AP突变体转染在促进轴突生长方面同样有效，而用KXGA突变体转染没有效果。误差条显示SE。
图3
图3
用MARK2转染N2a细胞可促进神经突起的形成，显性阴性MARK1可抑制神经突起形成。（a和c）MARK2染色（抗体12CA5）。（b和d）微管蛋白染色（抗体DM1A）。（a和b）虽然只含有低水平内源性τ的细胞在分化前血清中没有神经突起（参见b中的向上舍入细胞，星号），并且需要分化条件来发展过程（血清提取、维甲酸等），用MARK2转染克服了这一障碍，使60%的转染细胞即使不需要取血清和维甲酸也能分化和延伸轴突（见a和b中央的细胞，箭头和直方图）。（c和d）当用dnMARK2转染N2a细胞时，只有一小部分表达dnMARK 2的细胞（6%）在分化后形成延伸的轴突（图3e）。
图4
图4
非活性MARK2（dnMARK1）或非磷酸化Tau（KXGA）抑制神经突起生长。稳定转染htau40的N2a细胞可以通过血清提取和维甲酸进行分化（见b和c，星号）。然而，dnMARK2可防止神经突起形成（见a，箭头）。（d） 直方图显示dnMARK2抑制轴突（约90%的转染细胞不能形成轴突）。（a–c）显性阴性突变体（dnMARK2）在N2a/htau40细胞中的表达。（a） dnMARK2染色（抗体12CA5）。（b） τ染色（K9JA）。（c） 微管蛋白染色（DM1A）。（e–g）N2a细胞与GFP-MARK2和KXGA/htau23瞬时共转染，然后分化。双转染细胞（箭头）显示无突起，而未转染细胞有延伸的突起。（h） 直方图显示转染后带有延伸轴突的N2a比例：对照N2a细胞、转染htau23、MARK2、htau23-KXGA突变体的细胞、转导htau23-GXGA和MARK2。数据表明，htau23和MARK2促进神经突起的生长，htau23-KXGA取消了这种激活，甚至MARK1也无法挽救KXGA-tau突变体对分化后神经突起形成的抑制作用，因为其KXGS基序的tau磷酸化被阻断。
图5
图5
MARK2诱导的tau磷酸化。（a–c）瞬时转染GFP-MARK2的N2a/htau40细胞，24小时后分化、固定，并用荧光显微镜进行分析。（a） GFP-MARK2的分布。（b） 抗活性MARK2（磷酸化T-loop）的p-MARK抗体的免疫荧光。（c） 针对tau的磷酸化KXGS基序的抗体12E8。注意，KXGS位点的活性MARK2和磷酸化tau共定位（见下文）。（d和e）N2a/htau40细胞瞬时转染MARK2或显性阴性突变体（dnMARK1），分化6 h，并通过制备细胞裂解液和用一组磷酸化MARK 2和tau抗体进行Western blotting检测进行分析。数据表明，MARK2导致tau的KXGS基序磷酸化，而dnMARK1抑制这一点。（d） 通道1，控制N2a/htau40细胞提取物。通道2，转染MARK2。泳道3，用显性阴性MARK2（T208A和S212A）转染。抗体K9JA（“Tau”）可独立于磷酸化作用对Tau进行染色。这三个样品含有相同数量的τ。针对tau重复序列1和4中磷酸化KXGS基序的抗体12E8（phospho-S262和-S356，“p-tau”）在MARK2转染的情况下显示出较强的染色（第2道），但在未转染MARK1的情况下仅显示出弱染色（第1道），而在dnMARK2中未显示出染色（第3道）。抗血凝素标记的抗体（“MARK”）显示外源性MARK2或dnMARK1的表达（第2和第3道），但在未转染的细胞（第1道）中不存在。针对MARK2上磷酸化T-loop肽的抗体SA6941（pT208，pS212，对应于活化的MARK1）在外源性MARK 2转染后显示出明显的染色（第2道），但在对照组（第1道）中只有弱染色，对应于内源性MARK-like激酶的活性，而在dnMARK存在下没有染色。（e）用MARK2或显性阴性突变体dnMARK2瞬时转染N2a/htau40细胞，分化6小时，并在收获前用0.2μM冈田酸处理30分钟。请注意，只有表达转染wt MARK2而非dnMARK1的样品与抗体12E8反应后，KXGS基序的磷酸化明显增加（“p-Tau”，通道2）。这意味着MARK2而非其他内源性激酶，如PKA，在这些条件下负责KXGS基序的tau磷酸化。（f和g）Western blot分析证明p-MARK抗体（多克隆抗体SA6941）对激酶MARK2激活环中的正磷酸化位点T208和S212具有特异性。顶部，通过脑提取物激酶活性进行磷酸化之前（通道1）和之后（通道2）的MARK2蛋白（见材料和方法）。底部，抗体p-MARK（SA6941）只识别磷酸化的MARK2（通道2），其活性增加如直方图（g）所示。（h–j）N2a/htau40细胞瞬时转染HA标记的MARK2，分化24小时后固定，并用共焦荧光显微镜进行分析。（h） 利用荧光HA抗体分布MARK2。（i） 卵磷脂标记肌动蛋白的荧光。（j） h和i的合并。注意，MARK2和肌动蛋白在很大程度上共定位。
图6
图6
激酶抑制剂FL和HD对稳定转染htau40的N2a细胞中tau诱导的突起生长的影响。（a） 对对照N2a/htau40细胞进行分化，并用tau抗体K9JA进行免疫荧光染色；～25%的细胞发展出扩展的细胞过程。（b） N2a/htau40细胞分化并用50μM FL处理，FL是cdk5和GSK-3β的强抑制剂（Leclerc等。, 2001). 神经突起生长有所增强（～35%）。（c） N2a/htau40细胞分化并用50μM HD处理，HD也是cdk5和GSK-3β的强抑制剂（Meijer等。, 2000). 神经突起生长受到强烈抑制（～3%）。（d） 显示分化和用激酶抑制剂HD和FL处理后的N2a/htau40细胞中含有延伸轴突的部分的直方图。HD强烈降低轴突形成的程度，FL导致轻微增加。
图7
图7
激酶抑制剂FL和HD对Sf9细胞中tau诱导的过程生长的影响。（a） 未经处理的Sf9细胞（对照），呈圆形），无细胞突起。（b） 杆状病毒载体转染htau23的Sf9细胞30%的扩展细胞进程增长到100μm。它们也有较大的细胞体（2到3倍）。（c） 转染htau23并用激酶抑制剂FL（50μM）处理的Sf9细胞。具有突起的细胞数量急剧增加（～3倍）。（d） 转染htau23并用激酶抑制剂HD（50μM）处理的Sf9细胞。有过程的细胞数量下降到～10%。（e） 直方图显示了在激酶抑制剂存在下Sf9细胞形成过程的效率。HD强烈抑制它们，LiCl和H89适度促进，FL强烈促进。
图8
图8
激酶抑制剂对Sf9细胞中htau23磷酸化的影响。（a和b）抗体印迹。（c和f）2D磷酸肽图。（a） 车道1，无抑制剂（对照）。车道2，50μM HD。通道3，50μM FL。从上到下：考马斯染色凝胶（对照）显示大致等量的τ；用抗体K9JA进行免疫印迹，该抗体独立于磷酸化识别tau；抗体12E8（针对磷酸化KXGS基序）。抑制剂HD阻止磷酸化（通道2），因为它抑制MARK和相关激酶，而不是因为它抑制GSK-3β（见下文）。LiCl和PKA抑制剂没有明显效果（图8b，车道1和2）。抗体AT-100（针对磷酸-T212和S214）。该表位需要GSK-3β（磷酸化T212）和PKA（磷酸化S214；Zheng-Fischhofer等。, 1998). 因此，该表位被HD和FL（通道2和3）阻断。抗体AT-180（针对磷酸-T231和S235）。这是一个由cdk5和GSK-3β诱导的表位，因此信号被HD和FL阻断（第2和第3通道）。抗体AT-8（针对磷酸化S202和T205）。这是一个主要由cdk5诱导的表位，因此信号被HD和FL阻断（第2和第3通道）。PHF-1抗体（针对磷酸-S396和S404）。该表位主要被GSK-3β磷酸化，因此信号被HD抑制，但较少被FL（b）Lane 1，50 mM LiCl抑制。通道2，50μM H89，PKA抑制剂。（c–f）在Sf9细胞中表达的htau23蛋白的二维磷酸肽图，通过不含（c）或存在激酶抑制剂（d–f）的内源性激酶磷酸化。（c） 对照组，tau在Sf9细胞中表达。（d） 50μM HD抑制cdk5、GSK-3β和MARK。（e）50 mM LiCl抑制GSK-3。（f） 50μM FL抑制cdk5和GSK3β；注意，c、e和f显示磷酸化S262的斑点（圆圈，也见e中较高暴露时的插入部分），d没有，因为HD抑制MARK活性。
图9
图9
抑制剂HD和FL.（a）MARK2对τ激酶的体外抑制试验。（b） GSK3β。注意GSK-3β被HD（IC）抑制50=0.13μM）和FL（IC50=0.55μM），但MARK2主要受HD（IC）抑制50=0.67μM），而FL只是一种弱抑制剂（IC50=38μM）。
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