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.2002年10月29日；99(22):14071-6.
doi:10.1073/pnas.182542899。 Epub 2002年10月21日。

平滑活性的小分子调节

詹姆斯·K·陈 1, Jussi Taipale公司, 基思·E·杨, 塔潘·麦蒂, 菲利普·A·比奇
附属公司

平滑活性的小分子调节

詹姆斯·K·陈等。 美国国家科学院程序. .

摘要

Smoothened（Smo）是G蛋白偶联受体的远亲，在胚胎发育过程中介导Hedgehog（Hh）信号传导，并能在肿瘤发生中启动或传递配体依赖性通路激活。虽然调控Smo功能的细胞机制尚不清楚，但植物源甾体生物碱环胺对Smo的直接抑制表明可能与内源性小分子有关。在这里，我们证明了SAG，一种含氯苯并噻吩的Hh途径激动剂，以拮抗环胺作用的方式与Smo七烯束结合。此外，我们还发现了四种直接抑制Smo活性但在结构上与环胺不同的小分子。对这些化合物的功能和生物化学研究为Smo的小分子调控提供了证据，并为Smo活性的生理调控提供了见解。Smo拮抗剂之间的机制差异可能有助于Hh信号的治疗操作。

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图1。
图1。
SAG在Hh途径中作用于Ptch1下游，并抵消环胺对Smo的抑制作用。(一)SAG的化学结构及其在Shh-LIGHT2细胞中的活性。(B类)SAG诱导萤火虫萤光素酶在具有EC的Shh-LIGHT2细胞中的表达50然后在较高浓度下抑制表达。为了进行比较，由2nM ShhNp诱导的荧光素酶活性由绿线指示。(C类)SAG诱导P2β-半乳糖苷酶表达第1部分−/−用100 nM KAAD-环磷酰胺处理的细胞。β-半乳糖苷酶活性表明这些细胞中的Hh途径激活，因为该报告酶的表达受第1部分发起人，以及第1部分自身是Hh信号转导的转录靶点。绿线和红线分别表示未经药理调节和仅使用100 nM KAAD-环帕明时观察到的β-半乳糖苷酶活性。(D类)SAG在1.5μM KAAD-环磷酰胺处理的SmoA1-LIGHT2细胞中诱导萤火虫荧光素酶表达。绿线和红线分别表示了在没有小分子和仅存在1.5μM KAAD-环帕明的情况下的荧光素酶活性。(E类)环磷酰胺和SAG对Shh-LIGHT2细胞Hh通路激活具有拮抗作用。抑制由100 nM SAG（红色痕迹）诱导的荧光素酶表达所需的KAAD-cyclopamine浓度是阻止由4 nM ShhNp（黑色痕迹）诱导荧光素瘤表达所需浓度的15倍。相对荧光素酶活性根据最大活性水平进行标准化。(F类)同样，在用200 nM KAAD-环帕明（红色痕迹）处理的细胞中，激活Hh途径所需的SAG是激活未处理的Shh-LIGHT2细胞（黑色痕迹）中相应水平的途径所需SAG的20倍。(G公司)Smo-Myc的ER-localized（白色箭头；见文本和参考文献25）和post-ER（黑色箭头）形式的交叉链接三在Cos-1细胞中125SAG以剂量依赖的方式抑制I标记的PA-环帕明(顶部). Smo-Myc的细胞水平三不受激动剂治疗的影响(底部). (H（H）)Ptch1以剂量依赖的方式抑制SAG诱导的通路激活。用Gli-dependent萤火虫荧光素酶报告子和不同数量的Ptch1表达结构瞬时转染NIH 3T3细胞。然后用一系列SAG浓度处理转染细胞，显示了每种转染量的Ptch1 cDNA的最大荧光素酶活性。所有萤火虫荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性均为三个实验的平均值，并相对于对照报告者进行了标准化。
图2。
图2。
SAG直接与Smo七螺旋束结合。(一)光亲和试剂PA-SAG的化学结构及其在Shh-LIGHT2细胞中的活性。(B类)125I标记的PA-SAG交联Smo-Myc的ER后形式三（黑箭头）在光激活后表达于Cos-1细胞中，该反应被150 nM SAG抑制(左侧). Smo-Myc的ER定位形式三（白色箭头）未检测到交联，表达GFP的细胞作为对照或SmoA1-Myc三不会产生特定的交联产物。由PA-SAG非特定标记的内源性Cos-1蛋白用星号表示。Smo-Myc的表达水平三和SmoA1-Myc三如西方分析所示(赖特). (C类)SAG竞争ER后Smo-Myc的PA-SAG交联三(左侧)以类似于其抑制Smo-Myc的PA-cyclopamine交联的能力三（见图1G公司). ER后Smo-Myc的细胞水平三不受SAG影响(赖特). (D类)KAAD-环帕明抑制ER后Smo-Myc的PA-SAG交联三，但浓度大于其表观浓度K（K）D类对于Smo（23 nM；参考25），需要(左侧). ER后Smo-Myc的表达水平三显示用于比较(赖特). (E类)SAG竞争BODIPY-环胺与Smo表达细胞的结合，SAG/Smo复合物的表观解离常数为59 nM。(F类)具有类似效力的150 nM SAG抑制了BODIPY-环胺与表达Smo、SmoΔCRD或Smo△CT的Cos-1细胞的结合，表明SAG结合位点定位于Smo七螺旋束。
图3。
图3。
从10000个小分子的筛选中鉴定出Smo拮抗剂。(一)Shh-LIGHT2分析中SANT的化学结构及其活性。图中使用的颜色编码方案由蓝色、绿色、橙色和红色线条表示。(B类)SANT化合物抑制ShhNp诱导的萤火虫荧光素酶在Shh-LIGHT2细胞中的表达。(C类)SANT分子阻断BODIPY-环胺与Smo-expressing Cos-1细胞的结合，但SANT-1和SANT-3无法将BODIPY-环胺结合降低到非特异性水平。灰线表示在500 nM KAAD-环帕明存在下由细胞BODIPY-环胺水平定义的非特异性结合。(D类)用100 nM SANT-1（蓝色痕迹）、150 nM SANT-2（绿色痕迹）、500 nM SATT-3（橙色痕迹）或1μM SANT-4（红色痕迹）处理过的Shh-LIGHT2细胞，诱导荧光素酶表达所需的SAG浓度要高于诱导未处理Shh-LIGHT2细胞（黑色痕迹）中可比荧光素酶活性所需的浓度。(E类)与环胺及其衍生物不同，SANT化合物抑制SmoA1-LIGHT2细胞中的构成型萤火虫荧光素酶表达，其效力与抑制Shh-LIGHT2细胞中Shh信号所需的效力相似。注意，SANT-3不能完全抑制SmoA1-LIGHT2细胞中荧光素酶的表达。用15μM KAAD-环帕明处理过的SmoA1-LIGHT2细胞中的荧光素酶活性用灰色线表示。所有萤火虫荧光素酶活性是三个实验的平均值，相对于对照报告者和最大活性水平进行了标准化。
图4。
图4。
SAG作用的二价模型。SAG在低浓度或高浓度下对Hh通路的刺激或抑制可通过SAG与Smo和下游效应器的二价结合来解释。在这个模型中，Hh途径的激活通常涉及Smo分子亚群（蓝色）招募下游效应器（绿色）。在亚饱和浓度下，SAG（红色）可以结合Smo和效应器，从而促进Smo/效应器关联并增加通路活性水平。然而，较高浓度的SAG可以通过独立结合这两种蛋白质来抑制三元复合物的形成。
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