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.2002年10月4日;277(40):37551-8.
doi:10.1074/jbc。M206294200。 Epub 2002年7月26日。

用磷酸特异性抗体检测Na-K-Cl共转运体NKCC1的活化

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用磷酸特异性抗体检测Na-K-Cl共转运体NKCC1的活化

安德烈亚斯·弗莱默等。 生物化学杂志. .
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摘要

Na-K-Cl共转运体NKCC1通过其N末端调节域的磷酸化激活。在随附的论文中(Darman,R.B.和Forbush,B.(2002)J.Biol。化学。27737542-37550),我们确定了三种在这一过程中重要的磷酸苏氨酸。使用针对含有人类NKCC的Thr(212)和Thr(217)的二磷酸肽的磷酸特异性抗体(抗磷酸-NKCC1抗体R5),我们可以很容易地监测协同转运蛋白的激活状态。在直肠腺小管的(32)P磷酸化实验中,我们发现R5抗体信号与纳入NKCC1的(32;在NKCC1转染的HEK-293细胞的实验中,我们证明R5检测到的磷酸化直接反映了功能激活。鲨鱼直肠腺的免疫荧光分析显示,沿着基底外侧膜有活化依赖性R5抗体染色。在灌流的大鼠腮腺中,异丙肾上腺素沿基底外侧膜诱导腺泡和导管细胞染色。异丙肾上腺素还可诱导大鼠气管上皮细胞的基底外侧染色,而上皮下组织的基底细胞显示细胞膜的重非极化染色。在大鼠结肠中,激动剂刺激沿隐窝细胞的基底外侧膜诱导染色。这些数据为NKCC1在这些组织中的调节提供了直接证据,并进一步将NKCC1的磷酸化与其在转染细胞和自然组织中的激活联系起来。NKCC1、NKCC2和NCC家族成员中调节性苏氨酸残基的高度保守性,以及来自不同脊椎动物物种的组织表现出类似的R5结合特征,进一步支持了该调节位点在体内的作用。

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