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.2002年5月；13(5):1750-64.
doi:10.1091/mbc.01-12-0592。

COP介导的转运抑制剂和霍乱毒素抑制猴病毒40感染

阿兰西·A·理查兹 1, 埃斯彭·斯坦格, Rainer Pepperkok公司, 罗伯特·帕顿
附属公司
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COP介导的转运抑制剂和霍乱毒素抑制猴病毒40感染

阿兰西·A·理查兹等。 分子生物学细胞. 2002年5月.
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摘要

猿猴病毒40（SV40）是一种非包膜病毒，已被证明以一种明显新颖的感染进入途径从表面小窝传递到内质网。我们现在发现，最初的进入步骤被布雷费尔丁A阻断，并在20℃下孵化。进入步骤之后，病毒通过未知途径到达粗面内质网的一个域。这种细胞内运输途径也对布雷费尔丁A敏感。GTP-限制性ADP-核糖基化因子1（Arf1）和Sar1突变体的表达以及微量注射βCOP抗体可强烈抑制感染。此外，我们证明二肽N-苯甲酰氧羰基-Gly-Phe-amide可以有效抑制SV40感染，它也可以抑制霍乱毒素作用的晚期事件。我们的结果确定了新的SV40感染抑制剂，并表明SV40需要依赖COPI和COPI的转运步骤才能成功感染。

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数字

图1
图1
SV40在ER PDI-阳性亚结构域中的电镜定位。Vero细胞在37°C下与SV40孵育18至21小时，然后固定和处理epon包埋（A和B）或冰冻切片（C）。（A和B）SV40聚集在粗糙内质网的一个区域。病毒颗粒（大箭头）位于粗糙内质网膜的光滑区域；核糖体（B中的小箭头）在连接到含有SV40的结构的池中很明显。（C） 标有SV40（大金色，大箭头）和PDI（小金色，小箭头）的冰冻切片，显示病毒与ER标记的共定位。N、 细胞核。棒材，200 nm。
图2
图2
SV40感染早期事件的BFA敏感性。高尔基体标记物giantin的免疫标记显示，0.1μg/ml BFA处理3 h（B）可以破坏Vero细胞的高尔基复合体（参见A中未处理的细胞）。用0.1μg/ml BFA处理Vero细胞3小时，然后在药物持续存在的情况下用SV40感染21小时，观察到对病毒感染的有效抑制（E；+BFA对照）。SV40的免疫标记（绿色）和DAPI的核染色（蓝色）显示，BFA（D）处理的细胞周围有病毒积聚，这种模式与未处理的细胞（C）明显不同。（E） 当在感染开始后的不同时间点应用3h BFA治疗时，SV40感染早期而非晚期事件对药物的敏感性是明显的。给出了一个具有代表性的实验。（F） BFA抑制SV40的内化。允许在0.5μg/ml BFA中培养1 h的Vero细胞在37°C的温度下，在药物存在或不存在的情况下内化SV40 2 h。随后将细胞暴露在SV40中和抗血清中，可以在没有药物的情况下，在感染46小时之前灭活所有表面暴露的病毒。T-ag的固定和免疫标记显示，与未经处理的对照组相比，BFA处理的细胞中病毒感染对中和抗血清的敏感性大大提高。给出了一个具有代表性的实验。感染效率与未接触中和抗血清的对照组的感染效率标准化。（G） Vero细胞的Epon切片在0.3μG/ml BFA中培养3小时，然后在药物存在下感染SV40 21小时。薄片显示细胞表面积聚病毒颗粒，如插图中低倍放大所示。病毒在表面上正常的小窝状内陷（箭头）中积聚。空腔也很明显（箭头）。（H） BFA抑制SV40的细胞内运输。在接触中和抗血清之前，Vero细胞在37°C下感染SV40 2 h。随后，在感染的剩余20小时内，使用或不使用0.5μg/ml BFA进行培养，然后对T-ag进行固定和免疫标记。细胞计数显示，与未经处理的对照相比，BFA处理的细胞对感染有很强的抑制作用。感染效率与未经治疗的对照组相比正常化。给出了一个具有代表性的实验。棒材，20μm（A–D）和100 nm（G）。
图3
图3
SV40内化在20°C时被抑制。在用SV40中和抗血清中和表面暴露的病毒之前，用SV40在20或37°C下感染Vero细胞4小时。随后在37°C下孵育24小时后，固定细胞并对其进行T-ag免疫标记。定量感染效率显示，20°C下感染后病毒对中和抗体的敏感性比37°C感染后大得多。感染效率标准化为未接触中和抗血清的对照组。给出了一个具有代表性的实验。
图4
图4
在20°C和BFA条件下，CT-B的早期内体到高尔基体的转运受到抑制。将Vero细胞在0.5μg/ml CT-B-FITC中于20°C孵育1小时，导致毒素在EEA1阳性早期内体（箭头）中积聚，并且毒素无法到达高尔基复合体（a–C）。同样，在继续存在BFA的情况下，用0.5μg/ml BFA预处理2小时，然后将CT-B-FITC内化，导致毒素传递到EEA1阳性早期内体（箭头），即使在37°C（D–F）下1小时后也不会到达高尔基复合体。在BFA处理的细胞中，通过与共内化转铁蛋白-Texas Red（G和I）共定位，在一个被确定为再循环内体的小管室中也观察到了CT-B-FITC。棒材，10μm。
图5
图5
通过微量注射βCOP抗体抑制SV40感染。Vero细胞被微量注射βCOP抗体、抗EAGE，并受到SV40感染。病毒核抗原T-ag（红色）和微量注射抗体（绿色）的固定和双重免疫标记可分别检测感染细胞和注射细胞（A）。细胞计数显示βCOP抗体（B）显著抑制SV40感染。给出了三个独立实验的平均值和SEM。棒材，20μm。
图6
图6
Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）对SV40感染的抑制作用。将Arf1（Q71L）和GFP表达质粒（a）的混合物或GFP质粒（C）注入Vero细胞，并孵育5小时，以使蛋白质表达发生。βCOP（B和D）免疫标记显示，在表达GFP和Arf1（Q71L）（A和B）的细胞中，高尔基βCOP标记模式明显中断或完全缺失，但在仅表达GFP（C和D）的细胞内没有。对这些细胞进行SV40感染和感染效率的定量显示，与单独表达GFP的细胞相比，Arf1（Q71L）转染的细胞具有有效的抑制作用（E）。在类似的实验中，GTPase缺陷的Sar1突变体也能显著抑制SV40感染（F）。图表显示了三个独立实验的平均值和SEM。转染细胞的感染效率已与周围未转染细胞正常化。棒材，40μm。
图7
图7
ts-045-G的外周血转运被Sar1（H79G）和Arf1（Q71L）抑制。将GFP标记的ts-045-G表达质粒单独（A）或与ts-045-G和Sar1（H79G）（B）或Arf1（Q71L）（C）表达质粒的混合物注入Vero细胞。随后在限制温度（39.5°C）下培养3小时，允许突变蛋白的表达和ts-045-G在ER中的积累（我们的未发表数据）。在允许温度（31°C）下再培养3小时，可将ts-045-G输送至仅表达该突变的细胞的质膜（A）。然而，在表达Sar1（H79G）（B）或Arf1（Q71L）（C）的细胞中，ts-045-G仍滞留在内质网和核周聚集物中，从未到达质膜。棒材，20μm。
图8
图8
Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）抑制CT向高尔基复合体的转运。将GFP与Arf1（Q71L）（a-D）或Sar1（H79G）（E-H）表达质粒的混合物注入Vero细胞。蛋白表达5小时后，让细胞结合CT-B-FITC或未标记的全毒素，并在37°C下内化40分钟。注射细胞（通过A、C、E和G中显示的GFP表达进行鉴定）显示毒素内化到早期内体，但不内化到高尔基体（B、D、F和H中的轮廓细胞）。注射细胞的细胞表面也经常出现明显的毒素积聚，这可能反映了初始内化的轻微减少。棒材，20μm。
图9
图9
Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）抑制CT向ER的传输。将GFP与Arf1（Q71L）（a和B）或Sar1（H79G）（C–F）表达质粒的混合物注入Vero细胞，并在10μg/ml环己酰亚胺中培养4 h。然后，允许细胞在20°C下在没有环己酰氨的情况下结合并内化CT全毒素1 h，随后在37°C下再培养2 h。虽然毒素（B、D和F）在未注射的细胞（如A、C和E所示）中明显到达内质网，但表达Arf1或Sar1突变体的细胞（由A、C、E所示的GFP表达确定）在内质网中表现出明显的毒素缺乏，毒素在内体中积聚，有时在注射细胞中观察到高尔基体。棒材，10μm。
图10
图10
Cbz-gly-phe-NH2抑制SV40感染，但不抑制SFV感染。（A） Vero细胞用2 mM Cbz-gly-phe-NH2或其非活性类似物Cbz-gly-gly-NH2预处理1 h，或未经处理。在持续存在或不存在二肽的情况下，随后感染SV40，然后进行T-ag固定和免疫标记。感染效率定量显示Cbz-gly-phe-NH2持续抑制SV40感染，但不抑制其非活性类似物。给出了三个独立实验的平均值和SEM。（B） 用2mM Cbz-gly-phe-NH2预处理1小时或不处理的Vero细胞在药物持续存在或不存在的情况下受到SFV感染。感染效率的定量显示，处理细胞中没有抑制SFV感染。给出了三个独立实验的平均值和SEM。（C） 在继续使用该药物的情况下，在SV40感染21小时之前，用2 mM Cbz-gly-phe-NH2预处理Vero细胞1小时。然后清洗细胞，并在没有药物的情况下培养不同时间。虽然在洗脱药物后的前3小时内感染效率仍然较低，但在6小时后开始出现T-ag表达的恢复，并且在没有药物的情况下9小时后完全恢复。感染效率与未经治疗的对照组相比正常化。给出了一个具有代表性的实验。（D） 在SV40中和抗血清灭活表面暴露病毒之前，用SV40感染Vero细胞4小时。然后将细胞在含有2mM Cbz-gly-phe-NH2或其无活性类似物的培养基中再孵育20小时的感染。T-ag表达的定量显示二肽抑制剂能有效抑制感染。给出了三个独立实验的平均值和SEM。
图11
图11
Cbz-gly-phe-NH2对高尔基体后CT毒性的抑制作用。Vero细胞在2 mM Cbz-gly-phe-NH2（A和B）或其非活性类似物（C和D）中预先孵育，然后在药物持续存在下结合和内化CT-B-FITC（A和C）40分钟。然后固定细胞并免疫标记高尔基基质蛋白GM130（B和D）。在抑制剂处理的细胞中，高尔基复合体对CT-B的摄取没有明显差异。棒材10μm。
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    1. Anderson HA，Chen Y，Norkin LC。结合猴病毒40转位到富含小窝蛋白的膜域，其进入被选择性破坏小窝的药物抑制。分子生物学细胞。1996;7:1825–1834.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Anderson HA，Chen Y，Norkin LC。MHC I类分子在小窝中富集，但不会与猿猴病毒40一起进入。维罗尔将军。1998;79:1469–1477.-公共医学
    1. Aniento F，Gu F，Parton RG，Gruenberg J.一种内胚体β-COP参与了以pH为基础的运输囊泡的形成，运输囊泡最终到达晚期内胚体。细胞生物学杂志。1996;133:29–41.-项目管理咨询公司-公共医学
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