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.2002年4月30日;99(9):5965-70.
doi:10.1073/pnas.092152799。

无机焦磷酸酶对tRNAAla特性的调节

附属公司

无机焦磷酸酶对tRNAAla特性的调节

阿列克谢·德沃尔夫森等。 美国国家科学院程序. .

摘要

开发了一种高灵敏度的tRNA氨酰化分析方法,该方法通过氨基酸附着在3'-(32)P-标记的tRNA上,直接测量氨酰化tRNA的分数。当应用于大肠杆菌丙氨酸-tRNA合成酶时,该方法可以准确测量tRNA(Ala)最有害突变体的氨酰化。在没有和存在无机焦磷酸酶和延伸因子Tu的情况下,评估了tRNA(Ala)身份突变对氨酰化效率(k(cat)/k(M价值减少了几千倍。这些结果部分地调和了体内和体外tRNA(Ala)同一性分析之间的差异。

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数字

图1
图1
YFA2氨酰化的时间历程大肠杆菌通过我们的TLC分析或传统的掺入法测定AlaRS[H] 在1μM tRNA、20μM Ala和5()或10 nM AlaRS(B类). ()3′时程-32用TLC分析P标记的YFA2氨酰化反应。(B类)在双标签实验中通过TLC(●)或H合并(○)。
图2
图2
PPase对tRNA氨基酰化的影响大肠杆菌阿拉斯(B类)在1μM YFA2和0.25()、2.5(⋄)、25(□)或250(○)nM AlaRS下进行氨酰化。开放符号,不添加PPase;封闭符号,在PPase的存在下。(C类)在没有PPase的情况下进行YFA2氨酰化的时间过程(○)。在100 nM AlaRS和1μM tRNA下进行氨酰化。10分钟后,10单位/ml PPase(♦) 或添加100 nM AlaRS(□)。

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