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.2002年2月1日；21(3):303-13.
doi:10.1093/emboj/21.3.303。

泛素化和内吞缺陷的突变EGF受体揭示Grb2在负信号传递中的作用

哈达萨·沃特曼 1, 梅纳希姆·卡茨, 查南·鲁宾, 克伦·什蒂格曼, 萨拉·拉维, 阿里·埃尔森, 托马斯·乔文, 约瑟夫·亚登
附属公司

泛素化和内吞缺陷的突变EGF受体揭示Grb2在负信号传递中的作用

哈达萨·沃特曼等。 欧洲工商管理硕士J. .

勘误表in

  • EMBO J 2002年7月15日；21(14):3917

摘要

配体诱导的表皮生长因子受体（EGFR）脱敏由c-Cbl控制，这是一种结合多种信号蛋白（包括Grb2适配器）的泛素连接酶。与c-Cbl的负作用一致，这里我们报道EGFR的缺陷Tyr1045，一个可诱导的c-Cbl-对接位点，增强了对EGF的有丝分裂反应。信号增强是由于突变受体的加速再循环以及配体诱导的EGFR泛素化和内吞的伴随缺陷。内化缺陷突变体受体的动力学和形态学分析表明，c-Cbl介导的泛素化将EGFR分类为内吞作用和随后在溶酶体中的降解。然而，出乎意料的是，突变受体显示出显著的残余配体诱导的泛素化，尤其是在c-Cbl过度表达的情况下。潜在机制似乎涉及Grb2 c-Cbl复合物招募到EGFR的Grb2特异性对接位点，同时加速受体泛素化和脱敏。因此，Grb2除了在介导阳性信号方面具有独特的作用外，还可以通过加速活性酪氨酸激酶的c-Cbl依赖性分选而终止信号转导。

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数字

无
图1。在Tyr1045处有缺陷的突变体EGFR引发有效的信号并且对c-Cbl是难治的。(一)表达wt-EGFR（正方形）或Tyr1045突变体（Y1045F；三角形）的32D细胞亚系被去除IL-3，并以5×10的密度电镀5含有EGF系列稀释液的培养基中的细胞/ml。24小时后进行MTT分析。所得结果显示为相对于在没有添加生长因子的情况下保持的对照培养物的折叠诱导。(B类)32D细胞的指示亚系（5×105细胞/ml）与EGF以100 ng/ml（圈）的速度孵育不同的时间间隔。对照培养物在无IL-3（方形）或有IL-3（三角形）的情况下培养。每天使用比色MTT法测定细胞生长，并与时间零点观察到的信号进行比较。所示数据为四次测定的平均值±SD。(C类)用编码wt-EGFR（wt）或Tyr1045突变体（Y1045F）的质粒瞬时转染CHO细胞。此外，我们还使用了编码c-Cbl的向量或控制空向量。在37°C下用EGF（100 ng/ml）刺激细胞单层达到指定的时间间隔。用MAPK活性形式的特异性抗体分析全细胞裂解产物。(D类)CHO细胞与报告质粒（SRE-luc）共转染三倍，如图（C）所示。36小时后，细胞未经处理或用EGF（20 ng/ml）处理。在额外的12小时后，收集细胞进行荧光素酶分析。将获得的信号归一化为蛋白质浓度，并表示为平均±SD。
无
图2。EGFR的c-Cbl对接位点对于配体诱导的受体内吞和c-Cbl-内吞小泡的移位是必要的。在盖玻片上培养瞬时表达HA标记的c-Cbl的CHO细胞以及野生型GFP–EGFR（上面板），或包含Tyr1045突变的类似融合蛋白（Y1045F；下面板）。细胞在37°C下无EGF或有EGF（100 ng/ml）培养15分钟。为了观察c-Cbl，细胞被固定、渗透并与抗-HA抗体孵育，然后与Cy3-共轭二级抗体孵养（红色，中间柱）。GFP–EGFR荧光显示在左列（绿色）。右栏显示GFP和Cy3荧光的叠加，在共定位区域生成黄色。
无
图3。EGFR的c-Cbl对接位点对于配体的快速内吞和降解至关重要，它能够从循环途径中隔离。(一)将瞬时表达wt-EGFR（方形）、激酶缺陷型突变体受体（圆形）和Tyr1045突变体（Y1045F；三角形）的CHO细胞与放射性标记的EGF（2 ng/ml）在37℃孵育。在指定的时间，对细胞单层进行酸洗，以去除表面结合的EGF。酸性组分中的放射性以三倍和指定的表面相关配体进行定量。在细胞溶解后，对剩余的细胞相关放射性（内化）进行类似量化。显示每个时间点获得的比率（平均值±SD）。(B类)如（A）所示转染CHO细胞的单层细胞在20°C下与放射性标记的EGF孵育1小时。姐妹单层用氯喹（0.2 mM；开放符号）预培养30分钟。此后，对细胞进行清洗，并在37°C下保持指定的时间间隔。然后收集培养基，并溶解细胞。测定了三氯乙酸可溶性放射性，并给出了降解配体的分数。(C类)允许瞬时表达wt-EGFR（方形）、Y1045F突变受体（圆形）或激酶缺陷突变体（三角形）的CHO细胞在指定的时间段内内化放射性标记的EGF（1 ng/ml）。通过温和的酸洗去除剩余的表面结合配体。然后在4°C下用未标记的EGF培养加载EGF的细胞，然后在37°C下培养1小时。经过1小时追踪期后，从培养基中获得完整的放射性配体。同样，测定了表面结合放射性的分数，并将结合分数指定为回收配体。回收配体的比例表示为三次测定的平均±SD（bar）。
无
图4。独立于Tyr1045的替代受体泛素化途径可能涉及Grb2。(一)用编码wt-EGFR（wt）或Y1045F突变体的质粒以及编码c-Cbl和HA标记泛素的载体转染CHO细胞。48小时后，在37°C的温度下将细胞单层处理10分钟，不含或含EGF（100 ng/ml），并将细胞裂解物与所示抗体进行免疫沉淀（I.P.）和免疫印迹（I.B.）。还分析了全细胞裂解物（下面板）。(B类)从转染的HEK-293细胞中免疫纯化wt-EGFR或Y1045F突变受体。受体免疫沉淀物受到在体外用放射性标记的泛素进行泛素化分析。将c-Cbl、Grb2或这两种蛋白的组合以GST融合蛋白的形式添加到反应混合物中。通过电泳分离受体免疫沉淀物，并将蛋白质转移到过滤器中，首先对过滤器进行放射自显影（上面板，125I-Ub），然后用抗EGFR抗体进行免疫印迹（下面板）。(C类)Y1045F的免疫沉淀物受到在体外在一个或两个所示GST融合蛋白存在的情况下进行泛素化分析。作为对照，GST单独添加（续）或从反应中省略（未标记车道）。
无
图5。Grb2增强活细胞中c-Cbl依赖的泛素化和EGFR降解。(一)用编码EGFR指示形式的表达载体瞬时转染CHO细胞单层。此外，如图所示，使用编码c-Cbl、Grb2、HA泛素和对照空载体的质粒。细胞单层在37℃下处理10分钟，不含或含EGF（100 ng/ml）。随后，直接对细胞裂解物进行免疫印迹（I.B.；面板标记为NONE）。或者，首先分离EGFR，并用所示抗体分析免疫沉淀物。(B类)用编码所示形式EGFR的质粒以及编码Grb2和c-Cbl的质粒转染CHO细胞。用空表达载体处理对照培养物。在用EGF刺激后（100 ng/ml；37°C下10分钟），从细胞裂解物中分离出EGFR，并使用Grb2或EGFR抗体分析免疫复合物。
无
图6。Grb2加速Y1045F突变体EGFR的内化和下调。(一)用编码wt-EGFR（wt）或Y1045F突变体的表达载体转染CHO细胞。除此之外，我们还使用了编码c-Cbl（闭合圆）、Grb-2（开放方形）、Grb2和c-Cbl-（闭合方形）的组合或空控制向量（开放圆形）的质粒。转染后48小时，将培养物与EGF（25 ng/ml）在37°C下孵育指定的时间段。去除细胞结合配体，并通过在4°C下结合放射性标记的EGF来确定表面受体的水平。每个时间点显示了三次测定的平均±SD（bar）。(B类)如（A）所示，用载体转染CHO细胞单层，以驱动所示版本EGFR的表达。48小时后，用放射性标记的EGF（2 ng/ml）在37°C下培养细胞。在指定的时间点，对单层进行酸洗以去除表面结合配体。酸性组分中的放射性被指定为表面相关配体。剩余的细胞相关放射性在细胞溶解和指定的内化配体后分三次测定。符号如（A）所示。(C类)转染后48小时，在盖玻片上培养瞬时过度表达HA标记的c-Cbl和组氨酸标记的Grb2的CHO细胞，以及GFP–EGFR或包含Tyr1045突变的融合蛋白（Y1045F）。此后，在37°C的温度下培养细胞15分钟，不含或含EGF（100 ng/ml）。为了观察Grb2，细胞被固定、渗透并与兔抗-His孵育6然后是Cy3-结合二级抗体（红色）。GFP–EGFR荧光如左列所示（绿色）。右栏显示GFP和Cy3荧光的叠加；在共同定位区域可以看到黄色。
无
图7。c-Cbl的亚结构域参与受体泛素化。(一)用编码EGFR、Grb2、c-Cbl的HA肽标记突变体或空白对照载体的质粒转染CHO细胞。直接或免疫沉淀c-Cbl后，通过免疫印迹法分析全细胞提取物。使用了以下c-Cbl突变体：一种SH2结构域有缺陷的蛋白质（G306E）；和含有N端半[Cbl-N（RF），残基1–429]或C端半[Cbl-C，残基338至末端]的缺失突变体。(B类)在存在或不存在Grb2表达载体的情况下，用EGFR的Y1045F突变体以及c-Cbl的野生型（WT）或70Z突变体瞬时转染CHO细胞的单层。使用HA标记的泛素表达载体检测受体泛素化。转染后48小时，在没有EGF或有EGF（100ng/ml）的情况下孵育单层。用抗EGFR抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（I.P.），用HA-ubiquitin抗体或识别EGFR的抗体进行免疫印迹（I.B.）。(C类)CHO细胞与驱动所示c-Cbl突变体表达的载体共同转染[见（A）]，以及编码Y1045F突变体受体的质粒。如前所述，用编码Grb2的质粒或空白对照载体进行转染。所有转染都是在HA-标记泛素的质粒直接表达的情况下进行的。细胞在37°C下处理10分钟，不含或含EGF（100 ng/ml）。通过免疫印迹法（I.B.）直接（标记为NONE的面板）或免疫沉淀法（I.P.）对全细胞裂解产物进行分析。
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