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.2000年10月16日；19(20):5387-95.
doi:10.1093/emboj/19.20.5387。

MEKK2基因断裂导致ES细胞源性肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激导致细胞因子生成减少

T P加林顿 1, T石冢, P J帕普斯, K查亚马, S韦伯, T尤吉里, W太阳, S Sather公司, D M罗素, S B吉布森, G凯勒, E W Gelfand公司, G L约翰逊
附属公司

MEKK2基因断裂导致ES细胞源性肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激导致细胞因子生成减少

T P加林顿等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

高亲和力IgE受体（FcepsilonRI）或c-Kit的连接刺激肥大细胞中细胞因子的产生。我们发现，MEK激酶2（MEKK2）是一种调节JNK和ERK5通路的MAPK激酶激酶（MAP3K），是胚胎干细胞源性肥大细胞（ESMC）产生细胞因子所必需的。使用靶向性破坏MEKK2或MEKK1基因来消除ESMC中相应激酶的表达。与野生型ESMC相比，MEKK2（-/-）ESMC中针对IgE或c-Kit配体的特异性细胞因子转录显著减少。MEKK1（-/-）ESMC的细胞因子产生与野生型ESMC相似，表明MEKK2在信号细胞因子基因调控中的特异性。MEKK2（-/-）ESMC也失去了JNK的受体介导刺激。相反，JNK在紫外线照射下的激活是正常的，表明MEKK2是受体信号传递所必需的，但不是细胞应激反应所必需的。MEKK2是肥大细胞酪氨酸激酶受体信号传导控制细胞因子基因表达所需的第一个MAP3K。

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数字

无
图1。MEKK2受FcεRI连接刺激，并能刺激TNF-α启动子活性。(一)将含有小鼠5′-TNF-α的荧光素酶报告子构建物电穿孔至MC/9肥大细胞。然后用抗卵清蛋白IgE处理细胞过夜，清洗并用卵清蛋白（IgE-ova）处理。卵清蛋白刺激后6小时，细胞被裂解，荧光素酶活性被测定。经IgE-ova处理的细胞活性比未经处理的细胞高3-4倍。(B类)为了确定MC/9细胞的IgE-ova刺激对内源性MEKK2活性的影响，使用先前描述的方法（Fanger等., 1997). 在20分钟的时间过程中，IgE-ova刺激的MEKK2活性显示高达对照MEKK2活性的两倍，峰值在10分钟。(C类)为了确定MEKK2对TNF-α荧光素酶活性的直接影响，用野生型MEKK2[MEKK2-（WT）]、激酶活性MEKK2-[MEK02（KM）]或对照质粒（pCMV5）以及TNF-β荧光素瘤酶对MC/9细胞进行电穿孔。虽然激酶激活的MEKK2对荧光素酶活性没有影响，但野生型MEKK 2的转染导致荧光素素酶活性增加60倍，表明MEKK 2中的激酶活性对TNF-α启动子活性的正向调节很重要。累积起来，这些结果表明MEKK2参与了从FcεRI激活到TNF-α基因表达的通路的调节。
无
图2。MEKK2的基因靶向。(一)敲除矢量设计。外显子显示为填充框，并显示用作Southern blot分析探针的DNA片段的位置。起始位点（ATG）位于第一外显子的3′端。敲除区包括第一个外显子的一部分，该外显子包含起始位点以及下游内含子和以下外显子部分。B、，巴姆你好；N、，不是我；不，Nhe公司我；X、，Xba公司我；X小时，Xho公司我；Neo、新霉素耐药基因；胸苷激酶基因。(B类)Southern blot分析使用Xba公司我消化了基因组DNA。野生型DNA的片段大小为9kb。在敲除细胞中，片段大小为4.5 kb。(C类)蛋白质印迹分析。细胞裂解物中的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，转移到硝化纤维过滤器中，并用识别MEKK2 N末端的抗体进行检测。MEKK2 C末端的抗体也未能在MEKK2中检测到MEKK1–/–单元格（未显示）。
无
图3。MEKK2公司–/–与野生型ESMC相比，ESMC具有正常的肥大细胞形态、颗粒含量和FcεRI和c-Kit受体表达。(一)野生型和MEKK2的电子显微照片–/–ESMC。细胞培养4周。存在肥大细胞颗粒。短而具绒毛的突起，典型的肥大细胞（德沃夏克等.，1983），也可以在细胞表面上看到。(B类)野生型和MEKK2小檗碱染色–/–肥大细胞。小檗碱可使肝素染色，肝素是肥大细胞颗粒的一种成分（Enerback，1974；Metcalfe等., 1997). 中性粒细胞染色用作阴性对照（未显示）。(C类)Cy公司三-野生型和MEKK2标记抗体染色–/–乳糜酶的肥大细胞，一种肥大细胞颗粒特有的酶（Metcalfe等., 1997). （D和E）流式细胞术。用于c-Kit染色(D类)用FITC-抗c-Kit抗体处理细胞。阴性对照（阴影）未经治疗。FcεRI染色(E类)，用抗DNP IgE处理细胞，清洗，然后用FITC–抗IgE进行处理。阴性对照组（阴影）仅接受FITC–抗-IgE治疗。野生型和MEKK2–/–细胞表达两种受体的数量相等。在测试时，ES-derived肥大细胞培养物的培养时间为50-60天。
无
图4。(一)c-Kit配体（KL）刺激后ESMC中IL-4 mRNA表达的时间进程。肥大细胞被KL剥夺16小时。对于c-Kit结扎，细胞暴露于重组KL（250 ng/ml），然后在每个指定的时间点进行裂解和RNA提取。然后进行核糖核酸酶保护分析。结果显示，与MEKK2相比，野生型在刺激后0、30、60、90和120分钟产生IL-4 mRNA–/–ESMC如图所示。结果通过磷成像仪分析进行量化，并归一化为每个样本的L32和GAPDH mRNA表达水平。野生型ESMC中IL-4 mRNA的表达是MEKK2的5到10倍–/–ESMC。(B类)用IgE-ova和/或KL刺激ESMC后五种不同细胞因子mRNA表达的核糖核酸酶保护分析。肥大细胞被KL剥夺16h。对于c-Kit结扎，细胞暴露于重组KL（250 ng/ml）1 h。对于FcεRI结扎，细胞与抗卵清蛋白IgE（0.8µg/ml）孵育过夜，清洗并在37°C下孵育2小时。然后用10µg/ml的卵清蛋白处理它们1 h并进行裂解。对于共同刺激，用两种刺激物处理细胞1小时并进行裂解。(C类)通过磷成像仪分析进行定量，并将结果归一化为每个样本的L32和GAPDH mRNA表达水平。结果显示，MEKK2刺激1 h后，IL-4、TNF-α、IL-6和GM-CSF的mRNA生成减少–/–ESMC与野生型ESMC相比，而IL-9 mRNA的产生保持不变。
无
图5。RPA结果显示野生型和MEKK1中用KL刺激1小时后IL-4和TNF-α的mRNA生成–/–ESMC公司。肥大细胞被剥夺c-Kit配体（KL）16小时。对于c-Kit连接，将细胞暴露于重组KL（250 ng/ml）1小时并裂解。通过磷成像仪分析进行定量，并将结果归一化为每个样本的L32和GAPDH mRNA表达水平。结果表明，野生型与MEKK1相比，细胞因子mRNA的产生没有显著差异–/–ESMC。
无
图6。刺激ESMC或MC/9肥大细胞中的ERK、JNK、p38和BMK1/ERK5，以响应c-Kit和/或FcεRI结扎。肥大细胞被剥夺c-Kit配体（KL）16小时。对于c-Kit结扎，将细胞暴露于重组KL（250 ng/ml）30 min并进行裂解。对于FcεRI结扎，细胞与抗卵清蛋白IgE（0.8µg/ml）孵育过夜，清洗并在37°C下孵育2小时。然后用10µg/ml的卵清蛋白处理15分钟并进行裂解。对于与KL和IgE-ova共同刺激，在卵清蛋白治疗前15分钟用KL处理细胞，因此用KL刺激30分钟，用ova刺激15分钟。对于紫外线刺激（UV-C），细胞在2 cm距离（100 J/m）处暴露32 s2)并在37°C下再培养一小时后溶解。使用GST–c-Jun的激酶分析测定JNK活性(1–79)结合谷胱甘肽–作为底物的Sepharose珠。(一)MEKK2对UV-C的JNK活性正常–/–ESMC与野生型ESMC的比较。(B类)MEKK2中的JNK活动–/–经KL、IgE-ova或KL和IgE-oba联合治疗后，ESMC显著降低。(C类)在MEKK1中也测量了JNK活性对FcεRI连接的反应–/–ESMC。JNK活性无差异，表明对JNK活动的影响是MEKK2特异性的。(D类)使用抗磷酸化p44/p42 MAPK抗体通过western blot评估ERK磷酸化程度。与JNK相比，野生型和MEKK2在磷酸化方面没有显著差异–/–看到了ESMC。(E类)为了测量p38活性，使用ATF-2作为底物的激酶分析（Abdel-Hafiz等., 1992; 汉族等., 1994). 与ERK相似，野生型和MEKK2之间p38-MAPK无差异–/–看到了ESMC。这些结果通过使用抗磷酸-p38抗体的蛋白质印迹得到证实。(F类)使用western blot分析测定MC/9肥大细胞中BMK1/ERK5的活性，以显示受刺激细胞中BMK1/ERK5蛋白的凝胶位移，表明BMK1/ER K5磷酸化。BMK1/ERK5的凝胶位移与激酶活性（加藤等., 1998). 如上所述，用IgE ova和KL刺激MC/9细胞。作为阳性对照（Abe等.，1996），用0.4M山梨醇处理细胞30分钟。结果表明，IgE-ova和KL均可增加受刺激肥大细胞的BMK1/ERK5活性。
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