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.2000年5月2日；19(9):2069-81.
doi:10.1093/emboj/19.9.2069。

Skp2的靶向破坏导致细胞周期蛋白E和p27（Kip1）的积累、多倍体和中心体过度复制

K Nakayama公司 1, H Nagahama先生, Y A南岛, M松本, I中明, K北川, M Shirane先生, 松线虫, T筑山, N石田, M北川, K Nakayama公司, S Hatakeyama公司
附属公司

Skp2的靶向破坏导致细胞周期蛋白E和p27（Kip1）的积累、多倍体和中心体过度复制

K Nakayama公司等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

泛素蛋白酶体途径在控制细胞周期调控因子的丰度方面起着重要作用。生成了缺乏Skp2的小鼠，该蛋白是Skp1-Cullin-F-box蛋白（SCF）泛素连接酶的一种F-box蛋白和底物识别成分。虽然Skp2（-/-）动物是活的，但突变小鼠的细胞核明显增大，具有多倍体和多个中心体，且生长速度减慢，凋亡增加。Skp2（-/-）细胞还表现出细胞周期蛋白E和p27（Kip1）的积累增加。Skp2（-/-）细胞在S期和G（2）期细胞周期蛋白E的消除受损，导致周期蛋白E周期性丧失。生化研究表明，Skp2与细胞周期蛋白E特异性相互作用，从而在体内外促进其泛素化和降解。这些结果表明，细胞周期蛋白E和p27（Kip1）的特异性降解是由SCF（Skp2）泛素连接酶复合物介导的，并且Skp2可能通过确定细胞周期调节物的丰度来控制染色体复制和中心体复制。

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数字

无
图1。有针对性地破坏小鼠细胞S期激酶相关蛋白2. (A类)小鼠靶向载体（pSKP2.KO）的结构细胞S期激酶相关蛋白2同源重组产生的突变等位基因的位点。编码外显子或外显子的部分用填充框表示，开框表示非编码部分。用作Southern blot分析探针的基因组片段显示为条纹框Pst（磅/平方英尺）指示与探针杂交的I片段。还指出了用于RT-PCR分析的一组引物（F1和F2）的位置。neo，与PGK启动子连锁的新霉素转移酶基因；tk，源自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因与PGK启动子连接。neo和tk的取向与细胞S期激酶相关蛋白2.限制站点：E1，生态RI；P、，Pst（磅/平方英尺）我；S2、，囊II类；史密斯，Sma公司我；Xb、，Xba公司I.未显示所有限制位置。(B类)小鼠尾部基因组DNA的Southern blot分析。DNA用Pst（磅/平方英尺）并用（A）中所示的探针进行杂交。(C类)RT-PCR分析细胞S期激酶相关蛋白2（上面板）或β-微管蛋白基因（下面板）细胞S期激酶相关蛋白2+/+,细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF公司。(D类)放射标记Skp2蛋白的免疫沉淀分析细胞S期激酶相关蛋白2+/+和细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF公司。Skp2的位置显示在右侧。(E类)男性代表细胞S期激酶相关蛋白2+/+和细胞S期激酶相关蛋白2–/–4周大的室友。(F类)男性代表性生长曲线细胞S期激酶相关蛋白2+/+,细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–老鼠。在三种基因型的雌性小鼠中，体重也存在类似的差异（数据未显示）。
无
图2。细胞核扩大和多倍体细胞S期激酶相关蛋白2–/–细胞。（A-F）成人肝脏切片的组织学分析细胞S期激酶相关蛋白2+/+(A类和B类),细胞S期激酶相关蛋白2+/–(C类和D类)和细胞S期激酶相关蛋白2–/–(E类和F类)老鼠。切片用苏木精和伊红（A、C和E）或福尔根溶液（B、D和F）染色。比例尺，25µm。(G公司)流式细胞术分析肝细胞DNA含量细胞S期激酶相关蛋白2+/+（上面板），细胞S期激酶相关蛋白2+/–（中间面板）和细胞S期激酶相关蛋白2–/–（底部面板）鼠标。细支气管切片的组织学分析(H（H）和我)和肾小管(J型和K（K）)来自细胞S期激酶相关蛋白2+/+（H和J）和细胞S期激酶相关蛋白2–/–（I和K）小鼠。切片用苏木精和伊红染色。比例尺，25µm。
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图3。Skp2缺失时生长速度降低，中心体异常扩增，凋亡发生率增加。(A类)的增长曲线细胞S期激酶相关蛋白2+/+,细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–通道2（左侧面板）和通道5（右侧面板）的MEF。数据是重复平板的平均值，每条曲线对应于不同动物的MEF。(B类)T淋巴细胞生长曲线细胞S期激酶相关蛋白2+/+（圆圈）和细胞S期激酶相关蛋白2–/–通过固定化抗CD3ε和抗CD28刺激（封闭符号）或不刺激（开放符号）的（方形）小鼠。数据是三份培养物的平均值±SD，表示为比吸光度（细胞培养物的吸光度值减去单独培养基的吸光度）。(C类和D类)细胞核增大细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF公司。细胞S期激酶相关蛋白2+/+（C） 和细胞S期激酶相关蛋白2–/–（D） MEF用Hoechst 33258染料（蓝色）染色，以显示细胞核的大小。箭头表示特异性检测到的异常微核细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF公司。比例尺，100µm。(E类–H（H）)中心体过度复制细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF公司。MEF来自细胞S期激酶相关蛋白2+/+（E和G）和细胞S期激酶相关蛋白2–/–（F和H）小鼠分别用抗中心蛋白（绿色）单独染色（E和F）或与抗α-微管蛋白（红色）和Hoechst 33258 DNA染料（蓝色）共同染色（G和H）。比例尺，10µm。(我)中心体数量的定量分析。数据表示为包含指定数量中心体的细胞百分比。(J型)自发性凋亡发生率增加细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF公司。细胞S期激酶相关蛋白2+/+（顶部面板），细胞S期激酶相关蛋白2+/–（中间面板）和细胞S期激酶相关蛋白2–/–（底部面板）。收获第2代的MEFs，用低渗荧光溶液染色，并进行流式细胞术。显示了具有代表性的结果，并显示了亚二倍体（凋亡）细胞的百分比。(K（K）)MEF中自发凋亡的定量分析。亚二倍体细胞百分比细胞S期激酶相关蛋白2+/+,细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–测定MEF，并将其表示为三份培养物的平均值±SD。学生统计分析t吨-对两个独立样本的测试产生了双尾第页-值<0.02和<0.05，用于比较细胞S期激酶相关蛋白2+/+和细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF及其之间细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–分别为MEF。
无
图4。细胞周期蛋白E的积累和周期性表达的丧失细胞S期激酶相关蛋白2–/–细胞。(A类)MEF中各种细胞周期调节因子的免疫印迹分析（IB）细胞S期激酶相关蛋白2+/+,细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–老鼠。安在体外CDK2激酶活性的测定也显示出来。(B类)细胞周期蛋白E和p27的丰度基普1在胎儿肝脏中细胞S期激酶相关蛋白2+/+,细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–老鼠。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的免疫印迹分析也显示为对照。(C类)MEF中cyclin E mRNA的Northern blot分析。聚腺苷化RNA制备自细胞S期激酶相关蛋白2+/+,细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF用小鼠cyclin E cDNA或β-actin cDNA（对照）探针进行Northern blot分析。(D类)流动率的脉冲追踪分析35S标记的细胞周期蛋白E细胞S期激酶相关蛋白2+/+,细胞S期激酶相关蛋白2+/–和细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF公司。(E类)p27缺乏作用基普1细胞周期蛋白E丰度的过度表达。用编码β-半乳糖苷酶（Ad-β-gal）或Flag表位标记p27的重组腺病毒载体感染野生型MEF基普1（第27页广告）。免疫印迹分析（IB）以及在体外检测CDK2激酶活性。星号表示重组标记为Flag的p27基普1. (F类)细胞周期蛋白E和p27的反向表达水平基普1通过腺病毒转移细胞S期激酶相关蛋白2基因导入细胞S期激酶相关蛋白2–/–MEF公司。用编码β-半乳糖苷酶（Ad-β-gal）或标记Skp2（Ad-Skp2）的重组腺病毒载体感染细胞。随后制备细胞裂解物，并用细胞周期蛋白E、p27抗体进行免疫印迹分析基普1、Flag（针对Skp2）、β-半乳糖苷酶、CDK2或α-微管蛋白。(G公司)S-G期间细胞周期蛋白E的消除受损2Skp2缺陷型MEFs的阶段。用抗细胞周期素E或抗α-微管蛋白（对照）进行免疫印迹分析。
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图5。Skp2与周期蛋白E的相互作用及其对周期蛋白E泛素化的影响。(A类)Skp2与细胞周期蛋白A和E的结合。293T细胞中单独或与Flag-Skp2一起表达Myc-tagged细胞周期蛋白B、D1或E。抗Myc免疫沉淀蛋白（Myc IP）通过抗Flag或抗Myc的免疫印迹分析。免疫沉淀输入的10%也用抗Flag进行免疫印迹分析。(B类)Skp2诱导的细胞周期蛋白A和E泛素化。按照（A）制备的免疫沉淀物用抗泛素或抗Myc进行免疫印迹分析。(C类)内源性Skp2与内源性细胞周期蛋白E的相互作用体内用抗细胞周期蛋白E或免疫前兔抗体（mock）从Jurkat细胞裂解液中免疫沉淀的蛋白质，用抗Skp2或抗细胞周期素E进行免疫印迹。免疫沉淀输入的10%也进行了免疫印迹。(D类)Skp2对细胞周期蛋白E泛素化的影响在体外纯化的重组蛋白与纯化的E1酶、NIH 3T3细胞裂解物的S100部分和泛素一起培养在所示的组合中。用抗泛素免疫印迹法分析与抗细胞周期素E反应混合物中的免疫沉淀蛋白。(E类)Skp2与Cul1相关，但与Cul3无关。HA-标记的GSK-3β（对照）、Cul1或Cul3以及Flag-Skp2在293T细胞中表达。用抗-HA或抗-Fag免疫印迹法分析用抗Flag免疫沉淀的蛋白质。免疫沉淀输入的10%也进行了免疫印迹。
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图6。针对Skp2介导的泛素化的游离细胞周期蛋白E。(A类)CDK2对Skp2介导的细胞周期蛋白E泛素化的影响体内293T细胞中单独或与标记的Skp2、HA标记的野生型（WT）CDK2或HA标记的CDK2激酶阴性突变体（KN）一起表达Myc-tagged cyclin E。抗Myc免疫沉淀蛋白通过抗Flag或抗HA免疫印迹分析。免疫沉淀输入的10%也进行了免疫印迹。(B类)细胞周期蛋白E突变体T380A和R130A与Skp2的相互作用以及CDK2对其泛素化的影响。293T细胞表达Myc-tagged野生型（WT）或突变型（T380A或R130A）cyclin E、Flag-Skp2和HA-CDK2。用抗Myc、抗Flag、抗CDK2或抗泛素免疫印迹法分析抗Myc免疫沉淀蛋白（该图与其他图相比过度暴露，以显示细胞周期蛋白E泛素化的基础水平）。免疫沉淀输入的10%也进行了免疫印迹。(C类)磷酸酶处理对FWD1–IκBα和Skp2–cyclin E复合物的影响。在293T细胞中表达Myc-cyclin E、Myc-IκBα、Flag-Skp2、Flag-FWD1和Flag-IKK2（IκB激酶2）。用抗Myc免疫沉淀的蛋白质接受（或不接受）磷酸酶（CIP）处理，然后用抗Flag或抗Myc进行免疫印迹分析。免疫沉淀输入的10%也进行了免疫印迹分析。(D类)序列免疫沉淀分析表明，只有游离的细胞周期蛋白E与Skp2结合并发生泛素化。用编码Myc-cyclin E和Flag-Skp2的表达质粒转染293T细胞。用抗Myc（第1道）或抗CDK2（第2道）对细胞裂解物进行免疫沉淀，并用抗CDK1、抗Myc、抗Flag或抗泛素对所得免疫沉淀进行免疫印迹分析。用抗CDK2免疫沉淀后保留在上清液（Sup）中的细胞周期蛋白E然后用抗Myc免疫沉淀并进行免疫印迹分析（泳道3）。对应于10%免疫沉淀输入的一部分细胞裂解物也用抗CDK2、抗Myc或抗Flag进行免疫印迹分析（通道4）。(E类)脉冲追踪分析Skp2和CDK2对细胞周期蛋白E周转率的影响。在293T细胞中表达并放射标记Myc-cyclin E、Flag-Skp2和CDK2。在没有同位素的情况下孵育指定时间后，用SDS-PAGE和放射自显影术分析用抗Myc免疫沉淀的放射性标记蛋白。
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