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.1999年6月1日；13(11):1382-97.
doi:10.1101/gad.13.11.1382。

鳞状上皮癌变过程中炎性肥大细胞上调血管生成

L M库森 1, W W雷蒙德, G Bergers公司, 莱格·韦伯斯特, O贝伦特森, Z Werb公司, G H考基, D哈纳汉
附属公司

鳞状上皮癌变过程中炎性肥大细胞上调血管生成

L M库森等。 基因开发. .

摘要

HPV16早期区域基因在转基因小鼠基底角质形成细胞中的表达引发鳞癌的多阶段途径。我们报告肥大细胞浸润和基质金属蛋白酶MMP-9/明胶酶B的激活与癌前病变中的血管生成转换相一致。肥大细胞浸润癌的增生、异型增生和侵袭性前缘，但不浸润实体瘤的核心，在那里，肥大细胞脱粒，紧贴毛细血管和上皮基底膜，释放肥大细胞特异性丝氨酸蛋白酶MCP-4（糜蛋白酶）和MCP-6（胰蛋白酶）。在体外生物测试中，MCP-6被证明是皮肤成纤维细胞的有丝分裂原，可在反应性基质中增殖，而MCP-4可激活前果胶酶B并诱导增生性皮肤成为血管生成性皮肤。值得注意的是，在肥大细胞缺陷（KITW/KITWWv）HPV16转基因小鼠中，癌前血管生成减弱。数据表明，该模型中的肿瘤进展涉及对组织异常的炎症反应的利用。因此，鳞状细胞癌发生过程中血管生成的调控是双相的：在增生、异型增生和浸润癌前区中，炎症肥大细胞被征用来重组基质结构和过度激活血管生成；在癌核内，肿瘤细胞中血管生成因子的上调明显使其在维持新生血管方面自给自足。

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数字

图1
图1
癌前新生血管形成期间毛细血管的形态和结构改变。5μm石蜡包埋组织切片的免疫组织化学染色检测毛细血管内皮细胞表达的CD31（红色染色）(A类)正常非转基因（-lm）耳部皮肤(B类)耳部皮肤增生(C类)耳部皮肤发育不良(D类)耳朵WDSC(E类)躯干M-PDSC中心，以及(F类)躯干M-PDSC的侵袭性前部（Inv前部），带有指示肿瘤扩展方向的箭头。（虚线）表皮-真皮界面或皮肤基底膜区的位置；（e） 表皮。棒材，44.6微米(A–F).
图2
图2
血管生成激活期间肥大细胞浸润。用苏木精（蓝色）复染的5μm石蜡包埋组织切片上的氯乙酸酯酶组织化学（红色染色）确定了肿瘤进展过程中浸润MC的位置(A类)非转基因窝伴侣（-lm）耳部皮肤(B类)耳部皮肤增生(C类和D类)耳部皮肤发育不良(E类)胸部中心M-PDSC(F类)在躯干M-PDSC的侵入前端。箭头指示肿瘤扩展的方向。(G公司)具有发育不良躯干损伤的凝集素灌注转基因小鼠的整体显微镜观察。深染肥大细胞（箭头）似乎直接粘附在血管生成性发育不良中真皮毛细血管（c）周围的基底膜上。(H（H）)用甲苯胺蓝染色MC中的变色颗粒。脱粒肥大细胞（箭头）出现在发育不良病变中，与皮肤基底膜（bm）和真皮毛细血管（c，箭头）紧密并列。（d） 真皮，（e）表皮。棒材，44.6微米(A–D、F); 89微米(E类); 19.7微米(G公司); 12.9微米(H（H）).
图2
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血管生成激活期间肥大细胞浸润。用苏木精（蓝色）复染的5μm石蜡包埋组织切片上的氯乙酸酯酶组织化学（红色染色）确定了肿瘤进展过程中浸润MC的位置(A类)非转基因窝伴侣（-lm）耳部皮肤(B类)耳部皮肤增生(C类和D类)耳部皮肤发育不良(E类)胸部中心M-PDSC(F类)在躯干M-PDSC的侵入前端。箭头指示肿瘤扩展的方向。(G公司)具有发育不良躯干损伤的凝集素灌注转基因小鼠的整体显微镜观察。深染肥大细胞（箭头）似乎直接粘附在血管生成性发育不良中真皮毛细血管（c）周围的基底膜上。(H（H）)用甲苯胺蓝染色MC中的变色颗粒。脱粒肥大细胞（箭头）出现在发育不良病变中，与皮肤基底膜（bm）和真皮毛细血管（c，箭头）紧密并列。（d） 真皮，（e）表皮。棒材，44.6微米(A–D、F); 89微米(E类); 19.7微米(G公司); 12.9微米(H（H）).
图3
图3
肿瘤皮肤中的淀粉酶和类胰蛋白酶。(A类)肿瘤皮肤中的糜烂和胰蛋白酶活性。这些值表示通过高离子强度萃取溶解的阴性窝鼠（N）、增生（H）、发育不良（D）和肿瘤（T）的耳部皮肤活检中的平均糜蛋白酶和类胰蛋白酶活性，归一化为萃取液中的蛋白质量±s.e.m.公司。); 每个组织样品用1 m培养5μl米糜烂或胰蛋白酶底物。图中显示了37°C下410 nm处吸光度的变化，单位表示每mg蛋白质每分钟裂解的底物μmoles。(B类)对发育不良耳朵mRNA中所有mMCP进行RT-PCR分析。显示的大小表示碱基对。对所有引物对进行对照RNA的特异性启动试验(C类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-4纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1), 2米K14-HPV小鼠耳NaCl提取物（5μg蛋白质）；（车道2) 2米氯化钠提取物SBTI-淀粉未结合部分（1μg蛋白质）；（车道三)，5μg纯mMCP-4，SBTI-海藻酸洗脱液。(D类)抗rat MCP-1 IgG与mMCP-4特异性反应。（车道1)耳朵粗高盐提取物（2μl）；（车道2)，2.5ng来自SBTI琼脂糖酸洗脱液的纯化的mMCP-4。(E类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-6纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1)来自的未绑定分数第页-氨基苯甲脒-琼脂糖色谱法，2μl；（车道2), 2米氯化钠提取物，未结合部分，2μl；（车道三)肝素-HPLC NaCl梯度洗脱的MMCP-6峰（240 ng）。分子质量以kD表示。
图3
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肿瘤皮肤中的淀粉酶和类胰蛋白酶。(A类)肿瘤皮肤中的糜烂和胰蛋白酶活性。这些值表示通过高离子强度萃取溶解的阴性窝鼠（N）、增生（H）、发育不良（D）和肿瘤（T）的耳部皮肤活检中的平均糜蛋白酶和类胰蛋白酶活性，归一化为萃取液中的蛋白质量±s.e.m.公司。); 每个组织样品用1 m培养5μl米糜烂或胰蛋白酶底物。图中显示了37°C下410 nm处吸光度的变化，单位表示每mg蛋白质每分钟裂解的底物μmoles。(B类)对发育不良耳朵mRNA中所有mMCP进行RT-PCR分析。显示的大小表示碱基对。对所有引物对进行对照RNA的特异性启动试验(C类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-4纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1), 2米K14-HPV小鼠耳NaCl提取物（5μg蛋白质）；（车道2) 2米氯化钠提取物SBTI-淀粉未结合部分（1μg蛋白质）；（车道三)，5μg纯mMCP-4，SBTI-海藻酸洗脱液。(D类)抗rat MCP-1 IgG与mMCP-4特异性反应。（车道1)耳朵粗高盐提取物（2μl）；（车道2)，2.5ng来自SBTI琼脂糖酸洗脱液的纯化的mMCP-4。(E类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-6纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1)来自的未绑定分数第页-氨基苯甲脒-琼脂糖色谱法，2μl；（车道2), 2米氯化钠提取物，未结合部分，2μl；（车道三)肝素-HPLC NaCl梯度洗脱的MMCP-6峰（240 ng）。分子质量以kD表示。
图3
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肿瘤皮肤中的淀粉酶和类胰蛋白酶。(A类)肿瘤皮肤中的糜烂和胰蛋白酶活性。这些值表示通过高离子强度萃取溶解的阴性窝鼠（N）、增生（H）、发育不良（D）和肿瘤（T）的耳部皮肤活检中的平均糜蛋白酶和类胰蛋白酶活性，归一化为萃取液中的蛋白质量±s.e.m.公司。); 每个组织样品用1 m培养5μl米糜烂或胰蛋白酶底物。图中显示了37°C下410 nm处吸光度的变化，单位表示每mg蛋白质每分钟裂解的底物μmoles。(B类)对发育不良耳朵mRNA中所有mMCP进行RT-PCR分析。显示的大小表示碱基对。对所有引物对进行对照RNA的特异性启动试验(C类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-4纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1), 2米K14-HPV小鼠耳NaCl提取物（5μg蛋白质）；（车道2) 2米氯化钠提取物SBTI-淀粉未结合部分（1μg蛋白质）；（车道三)，5μg纯mMCP-4，SBTI-海藻酸洗脱液。(D类)抗rat MCP-1 IgG与mMCP-4特异性反应。（车道1)耳朵粗高盐提取物（2μl）；（车道2)，2.5ng来自SBTI琼脂糖酸洗脱液的纯化的mMCP-4。(E类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-6纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1)来自的未绑定分数第页-氨基苯甲脒-琼脂糖色谱法，2μl；（车道2), 2米氯化钠提取物，未结合部分，2μl；（车道三)肝素-HPLC NaCl梯度洗脱的MMCP-6峰（240 ng）。分子质量以kD表示。
图3
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肿瘤皮肤中的淀粉酶和类胰蛋白酶。(A类)肿瘤皮肤中的糜烂和胰蛋白酶活性。这些值表示通过高离子强度萃取溶解的阴性窝鼠（N）、增生（H）、发育不良（D）和肿瘤（T）的耳部皮肤活检中的平均糜蛋白酶和类胰蛋白酶活性，归一化为萃取液中的蛋白质量±s.e.m.公司。); 每个组织样品用1 m培养5μl米糜烂或胰蛋白酶底物。图中显示了37°C下410 nm处吸光度的变化，单位表示每mg蛋白质每分钟裂解的底物μmoles。(B类)对发育不良耳朵mRNA中所有mMCP进行RT-PCR分析。显示的大小表示碱基对。对所有引物对进行对照RNA的特异性启动试验(C类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-4纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1), 2米K14-HPV小鼠耳NaCl提取物（5μg蛋白质）；（车道2) 2米氯化钠提取物SBTI-淀粉未结合部分（1μg蛋白质）；（车道三)，5μg纯mMCP-4，SBTI-海藻酸洗脱液。(D类)抗rat MCP-1 IgG与mMCP-4特异性反应。（车道1)耳朵粗高盐提取物（2μl）；（车道2)，2.5ng来自SBTI琼脂糖酸洗脱液的纯化的mMCP-4。(E类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-6纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1)来自的未绑定分数第页-氨基苯甲脒-琼脂糖色谱法，2μl；（车道2), 2米氯化钠提取物，未结合部分，2μl；（车道三)肝素-HPLC NaCl梯度洗脱的MMCP-6峰（240 ng）。分子质量以kD表示。
图3
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肿瘤皮肤中的淀粉酶和类胰蛋白酶。(A类)肿瘤皮肤中的糜烂和胰蛋白酶活性。这些值表示通过高离子强度萃取溶解的阴性窝鼠（N）、增生（H）、发育不良（D）和肿瘤（T）的耳部皮肤活检中的平均糜蛋白酶和类胰蛋白酶活性，归一化为萃取液中的蛋白质量±s.e.m.公司。); 每个组织样品用1 m培养5μl米糜烂或胰蛋白酶底物。图中显示了37°C下410 nm处吸光度的变化，单位表示每mg蛋白质每分钟裂解的底物μmoles。(B类)对发育不良耳朵mRNA中所有mMCP进行RT-PCR分析。显示的大小表示碱基对。对所有引物对进行对照RNA的特异性启动试验(C类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-4纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1), 2米K14-HPV小鼠耳NaCl提取物（5μg蛋白质）；（车道2) 2米氯化钠提取物SBTI-淀粉未结合部分（1μg蛋白质）；（车道三)，5μg纯mMCP-4，SBTI-海藻酸洗脱液。(D类)抗rat MCP-1 IgG与mMCP-4特异性反应。（车道1)耳朵粗高盐提取物（2μl）；（车道2)，2.5ng来自SBTI琼脂糖酸洗脱液的纯化的mMCP-4。(E类)K14–HPV16小鼠耳mMCP-6纯化的SDS-PAGE。样品用二硫苏糖醇还原，并用考马斯亮蓝显示。（车道1)来自的未绑定分数第页-氨基苯甲脒-琼脂糖色谱法，2μl；（车道2), 2米氯化钠提取物，未结合部分，2μl；（车道三)肝素-HPLC NaCl梯度洗脱的MMCP-6峰（240 ng）。分子质量以kD表示。
图4
图4
类胰蛋白酶对皮肤成纤维细胞的影响。MCPs对HUVEC增殖的影响(A类)以及对PMDF增殖的影响(B类). 将激动剂添加到缺乏血清的亚流培养物中（VEGF，1和10 ng/ml；bFGF，1和10ng/ml，mMCP-6，1和10-n）米; mMCP-4、2和20 n米; 肝素浓度分别为74和740 ng/ml），持续16小时[三H] 然后测定胸腺嘧啶掺入量。显示的结果表明平均值（±s.e.m.公司。;n个 = 3). (C–E类)来自(C类)阴性窝交配（-lm）正常皮肤(D类)增生性（hyp）皮肤，以及(E类)用（α1）I前胶原反义mRNA探针杂交异型增生（dys）皮肤。箭头指向基质中表达前胶原的细胞。（e） 表皮；（d） 真皮，（c）中耳软骨。棒材，44.6微米(C–E类).
图5
图5
mMCP-4对增生组织中存在的前天门冬氨酸酶B的影响以及mMCP-2和明胶酶B在体内的定位。(A类)正常（N）、增生（H）、增生异常（D）和癌（T）活检组织裂解物（2μl）中的胶溶活性。电泳后用1,10菲咯啉（MMPs抑制剂）而非PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）培养明胶酶谱，完全消除了68、72、80和90-kD条带（数据未显示）。(B类)明胶酶B活性的体外重建。两微升增生（H）裂解物或2微升增生裂解物与40 ng纯化mMCP-4在37°C下孵育30分钟。分子质量以kD表示。(C–D类)在发育不良皮肤的上皮（e）和毛细血管（c）附近的基底膜（bm，箭头）处，mMCP-4（红色染色）和层粘连蛋白（棕色染色）的免疫定位。(E类)明胶酶B（蓝色染色）在异型增生皮肤中的免疫定位位于真皮中靠近上皮（e，闭合箭头）和毛细血管（c，开放箭头）的基底膜（bm）。(F类)使用对照兔IgG控制非特异性结合；背景染色可以忽略不计。棒材，44.6微米(C–F类).
图5
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mMCP-4对增生组织中存在的前天门冬氨酸酶B的影响以及mMCP-2和明胶酶B在体内的定位。(A类)正常（N）、增生（H）、增生异常（D）和癌（T）活检组织裂解物（2μl）中的胶溶活性。电泳后用1,10菲咯啉（MMPs抑制剂）而非PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）培养明胶酶谱，完全消除了68、72、80和90-kD条带（数据未显示）。(B类)明胶酶B活性的体外重建。两微升增生（H）裂解物或2微升增生裂解物与40 ng纯化mMCP-4在37°C下孵育30分钟。分子质量以kD表示。(C–D类)在发育不良皮肤的上皮（e）和毛细血管（c）附近的基底膜（bm，箭头）处，mMCP-4（红色染色）和层粘连蛋白（棕色染色）的免疫定位。(E类)明胶酶B（蓝色染色）在异型增生皮肤中的免疫定位位于真皮中靠近上皮（e，闭合箭头）和毛细血管（c，开放箭头）的基底膜（bm）。(F类)使用对照兔IgG控制非特异性结合；背景染色可以忽略不计。棒材，44.6微米(C–F类).
图5
图5
mMCP-4对增生组织中存在的前天门冬氨酸酶B的影响以及mMCP-2和明胶酶B在体内的定位。(A类)正常（N）、增生（H）、增生异常（D）和癌（T）活检组织裂解物（2μl）中的胶溶活性。电泳后用1,10菲咯啉（MMPs抑制剂）而非PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）培养明胶酶谱，完全消除了68、72、80和90-kD条带（数据未显示）。(B类)明胶酶B活性的体外重建。两微升增生（H）裂解物或2微升增生裂解物与40 ng纯化mMCP-4在37°C下孵育30分钟。分子质量以kD表示。(C–D类)在发育不良皮肤的上皮（e）和毛细血管（c）附近的基底膜（bm，箭头）处，mMCP-4（红色染色）和层粘连蛋白（棕色染色）的免疫定位。(E类)明胶酶B（蓝色染色）在异型增生皮肤中的免疫定位位于真皮中靠近上皮（e，闭合箭头）和毛细血管（c，开放箭头）的基底膜（bm）。(F类)使用对照兔IgG控制非特异性结合；背景染色可以忽略不计。棒材，44.6微米(C–F类).
图6
图6
mMCP-4对癌前组织中隔离血管生成活性的影响。将1个月大的K14–HPV16小鼠的耳部皮肤（S）在37°C有无酶的条件下培养48小时，然后植入胶原蛋白凝胶中与EC共培养。培养维持3周，共培养12天后拍摄试管长入的照片。(A类)未经处理的耳部皮肤植入EC胶原凝胶；(B类)mMCP-6处理（10 n米)耳部皮肤植入EC胶原凝胶；(C类和D类)mMCP-4处理（20 n米)耳部皮肤植入EC胶原凝胶后显示出血管生成反应，并形成广泛的EC管。低放大倍数(D类)显示了管状结构朝向真皮（d）表面的极化方向，而不是皮肤的表皮（e）表面。小箭头(A类和B类)表示EC的无次序随机增长，而粗箭头(C类和D类)表示径向排列的小管向皮肤生长。（h） 头发。棒材：58μm(A–C); 116微米(D类).
图7
图7
肥大细胞缺乏可减轻早期肿瘤进展。肥大细胞的存在（CAE，红色染色；A–C)角质形成细胞增殖（Ki-67，棕色染色；D–F)，毛细血管结构和密度（CD-31，棕色染色；面板G–I型)比较了野生型同卵双胞胎（-LM；n个 = 三；A、 D类、和G公司)，K14–HPV16配套元件+/配套元件+(n个 = 8;B、 电子、和H（H）)和K14–HPV16配套元件W公司/KITW公司Wv公司(n个 = 1;C、 F类、和我)老鼠。从2个月大的同窝婴儿身上取下耳朵组织活检（5×2-mm），包埋在OCT冷冻介质中，并切片（10μm）。虚线表示表皮-皮肤界面。箭头指向增生皮肤下方扩张的毛细血管。（f） 毛囊。棒材，44.6微米(A–I类).
图8
图8
鳞癌发生过程中血管生成的双相控制模型。皮肤被分隔成由角质形成细胞和树突状细胞组成的无血管表皮，以及由成纤维细胞、各种造血细胞类型以及形成血管的内皮细胞和平滑肌细胞组成的血管化真皮，这些细胞嵌入静止的基质环境中。在癌前进展期间，癌上皮附近的基质类似于慢性伤口中观察到的基质，其特征是成纤维细胞增生，α1（I）前胶原合成增加，血管密度增加，血管通透性增加，ECM降解蛋白酶的表达和活性增加，多种白细胞增多，MC脱颗粒。MCs在早期病变中被肿瘤上皮细胞利用，并通过释放一些生物活性分子（例如bFGF、VEGF、肝素、组胺、糜蛋白酶和类胰蛋白酶）来启动血管生成。胰蛋白酶能增加血管通透性，是一种有效的有丝分裂原和成纤维细胞活化剂，也是α1（I）前胶原合成的诱导剂。乳糜酶虽然不是直接的有丝分裂原，但通过明胶酶B依赖和独立的机制，通过从基质贮存器释放隔离的血管生成活性，诱导血管生成激活。反应性基质细胞产生的明胶酶B虽然可能参与ECM重塑，但释放ECM隔离的血管生成活性，也刺激EC趋化性、增殖和管形成。相反，肿瘤基质内新生血管的维持是MC依赖性的。在完全恶性上皮细胞中，通过显著上调多种肝素结合生长因子基因，可能直接实现癌期内的血管生成维持。
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