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.1999年3月；19(3):2180-8.
doi:10.1128/MCB.19.3.2180。

蛋白激酶C亚型激活IkappaB激酶β

M J拉莱纳 1, M T直径-机械, G布伦特, C V Payá, J莫斯卡特
附属公司

蛋白激酶C亚型激活IkappaB激酶β

M J拉莱纳等。 分子细胞生物学. 1999年3月.

摘要

非典型蛋白激酶C（PKC）同型（lambda/iotaPKC和zetaPKC）已被证明与重要的细胞功能如增殖和存活密切相关。先前的研究表明，非典型PKC受到肿瘤坏死因子α（TNF-α）的刺激，并通过一种最可能涉及IkappaB磷酸化的机制被该细胞因子激活NF-κB所需。这些PKC同型不能直接磷酸化IkappaB，这导致了一种假设，即zetaPKC可能使用假定的Ikappa B激酶来对IkappbB进行功能性失活。最近，一些研究小组对两种IkappaB激酶（IKKalpha和IKKbeta）进行了分子表征和克隆，这两种激酶磷酸化了Ikappa B分子中的残基，从而将其作为泛素化和降解的靶点。在本研究中，我们探讨了不同PKC可能通过激活IKK来控制NF-kappaB的可能性。我们在这里报告了alphaPKC以及非典型PKC在体内外与IKK结合。此外，过表达zetaPKC可积极调节IKKbeta活性，但不调节IKKalpha活性，而转染zetaPKC-显性阴性突变体可严重损害TNF-α刺激细胞中IKKbeta而非IKKalbha的激活。我们还表明，用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐刺激细胞可激活IKKbeta，这完全依赖于αPKC的活性，但不依赖于非典型亚型的活性。相反，αPKC的抑制并不影响TNF-α对IKKβ的激活。有趣的是，重组活性ζaPKC和αPKC能够在体外刺激IKKβ的活性，但不能刺激IKKα的活性。此外，有证据表明，重组zetaPKC在体外直接磷酸化IKKbeta，涉及Ser177和Ser181。总之，这些结果证明了PKC亚型在NF-kappaB途径中IKKbeta激活和IkappaB-降解水平的关键作用。

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数字

图1
图1
PKC与IKK的体外相互作用。35如材料和方法中所述，单独或联合培养S-标记的IKKβ（A）或IKKα（B）和HA-标记的λ/γPKC、ζPKC、αPKC或Raf-1。IKKβ和IKKα用抗Flag抗体免疫沉淀（IP），免疫沉淀用SDS-PAGE分离，然后在InstantImager中放射自显影。平行装载等分（用于体外结合反应的标记蛋白量的十分之一）（Ext.）。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。（C） 三个独立实验的结果总结，其中35S标记的全长IKKβ或该激酶的两个片段（包含催化域（黑盒）或调节域（亮氨酸拉链[LZ]加上螺旋环-螺旋[HLH]）的标记标记版本与全长ζPKC或其催化物（ζPKC]）孵育CAT公司)和监管（ζPKC规则)区域，之后IKKβ如上文所述进行免疫沉淀，ζPKC结构的结合水平通过SDS-PAGE和放射自显影术测定。面板左侧的数字以千道尔顿表示分子质量标记的位置。
图2
图2
λ/λPKC和αPKC与体内IKKβ相互作用。用10μg pCDNA3或表达载体转染100 mm直径平板中293个细胞的亚流入培养物，表达HA-λ/l.PKC（A，左面板；B，右面板）、HA-αPKC（A，右面板；C，左面板）、HA-ζPKC；C）和足够的空载体，以提供20μg的总DNA。用10μg Flag-IKKβ或Flag-IKKα加上10μg HA-λ/∏PKC、HA-αPKC或HA-ζPKC转染平行培养物。转染后（36小时），用抗Flag抗体或抗HA抗体对细胞提取物进行免疫沉淀。免疫沉淀物在高盐缓冲液（500 mM NaCl）中广泛洗涤，用SDS-PAGE进行分离，并用抗HA或抗Flag抗体（IP）进行免疫印迹分析。将等分试样（用于免疫沉淀的提取物[Ext.]量的十分之一）装入平行凝胶中，并用相应的抗体通过免疫印迹进行分析。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。面板右侧的数字以千道尔顿表示分子质量标记的位置。WB、Western blot。
图3
图3
内源性λ/ⅦPKC与IKKβ和信号体的相互作用。（A和B）用每毫升20 ng TNF-α或PMA（5μM）刺激转染10μg Flag-IKKβ（A）或Flag-IKKα（B）的100-mm直径平板中293个细胞的亚流培养5分钟。然后，用单克隆抗Flag抗体免疫沉淀细胞提取物（200μg），用多克隆抗λ/ⅠPKC抗体进行免疫印迹（WB）分析免疫沉淀物。免疫沉淀物在平行凝胶中用抗Flag抗体进行免疫印迹分析。提取物（Ext.）含有20μg细胞蛋白。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。（C） 在直径为100 mm的平板中，293细胞的亚流动培养物用20 ng TNF-α/ml或PMA（5μM）刺激不同时间。随后，用多克隆抗MKP-1抗体对细胞提取物（200μg）进行免疫沉淀（IP），并用单克隆抗λ/l.PKC抗体对免疫沉淀进行免疫印迹（WB）分析。免疫沉淀在平行凝胶中用抗IKK抗体进行免疫印迹分析。提取物（Ext.）含有20μg细胞蛋白。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。
图4
图4
内源性λ/ⅦPKC与内源性IKK的相互作用。用每毫升20 ng TNF-α或PMA（5μM）刺激100-mm直径平板中293个细胞的亚流培养物5分钟。然后，用多克隆抗IKK抗体对细胞提取物（200μg）进行免疫沉淀（IP），并用单克隆抗-λ/∏PKC抗体对免疫沉淀进行免疫印迹（WB）分析。免疫沉淀在平行凝胶中用抗IKK抗体进行免疫印迹分析。提取物（Ext.）含有20μg细胞蛋白。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。
图5
图5
αPKC和ζPKC在PMA和TNF-α激活IKKβ中的作用。（A） 用Flag-IKKβ（10μg）转染直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物，转染36 h后，细胞未经处理或在用TNF-α（20 ng/ml）或PMA（5μM）刺激前15 min用GF109203X（10 nM）孵育7 min。之后，Flag-IKKβ被免疫沉淀，并用重组GST-IκB作为底物测定其活性水平，如材料和方法所述。（B） 用Flag-IKKβ（10μg）和10μg空质粒或表达载体转染直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物，以获得HA标记的野生型（ζPKC）重量)或显性阴性（ζPKCMUT公司)ζPKC。转染后36小时，细胞要么未经处理，要么用TNF-α（20 ng/ml）刺激7分钟。然后，对Flag-IKKβ进行免疫沉淀，并如上所述测定其活性水平。（C） 用Flag-IKKβ（10μg）和10μg空质粒或HA-标记显性负ζPKC（ζPKC-MUT公司). 转染后36小时，细胞未经处理，或用TNF-α（20 ng/ml）或PMA（5μM）刺激7分钟。之后，免疫沉淀Flag IKKβ，并如上所述测定其活性水平。（D） 用Flag IKKβ（10μg）和10μg空质粒或HA标记的显性阴性（λ/ιPKCMUT公司)λ/λPKC。转染后36小时，细胞要么未经处理，要么用TNF-α（20 ng/ml）刺激7分钟。然后，对Flag-IKKβ进行免疫沉淀，并如上所述测定其活性水平。（E） 用Flag-IKKα（10μg）转染直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物，转染36 h后，细胞要么未经处理，要么用TNF-α（20 ng/ml）刺激7 min。然后，对Flag-IKKα进行免疫沉淀，并按上述方法测定其活性水平。使用相应的抗抗原抗体测定不同结构的表达水平。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。P、 磷酸化蛋白。
图6
图6
重组活性ζPKC和αPKC在体外刺激IKKβ而非IKKα。（A） 在未经处理的293细胞中表达的Flag-IKKβ（左侧）或Flag-IKKα（右侧）免疫沉淀物与αPKC（由磷脂酰丝氨酸和二酰甘油最大程度激活）或ζPKC永久活性突变体（ζPKC-DEL公司)，均由昆虫细胞中的杆状病毒产生。在存在GST-IκB的情况下，在30°C下反应30分钟，然后如上所述测定IκB磷酸化水平。作为阳性对照，包括来自TNF-α活化细胞（20 ng/ml；7 min）的两种IKK的活性。（B） 以髓磷脂碱性蛋白（MyBP）为对照，测定这些实验中使用的PKC重组制剂的活性水平。（C） 在未经处理的293细胞中表达的Flag-IKKβ免疫沉淀物在没有GST-IκB的情况下与重组ζPKC在30℃孵育30分钟，然后测定IKKβ的直接磷酸化水平。左边的数字表示以千道尔顿为单位的分子质量标记的位置。（D，左图）如材料和方法中所述，通过FSBA处理使0.5或2 mg蛋白质提取物中的野生型IKKβ免疫沉淀物失活。随后，如上文所述，将其与重组ζPKC孵育或不孵育，并测定激酶活性IKKβ的磷酸化水平。（D，右图）用FSBA处理1 mg蛋白质提取物，使野生型（WT）或活化环突变体（AA）IKKβ的免疫沉淀物失活，如上所述，然后用或不用重组ζPKC孵育它们，并测定激酶活性IKK？的磷酸化水平。每个实验中的反应混合物在平行凝胶中用抗Flag抗体进行免疫印迹分析。在其他三个实验中获得了基本相同的结果。P、 磷酸化蛋白。
图7
图7
ζPKC在诱导IκB降解中的作用。将5μg标记的IκBα表达质粒和5μg p65表达载体与10μg HA-标记野生型（ζPKC）的控制载体或表达质粒转染293细胞亚流培养物重量)或显性阴性（ζPKCMUT公司)ζPKC。将转染后36小时的细胞与环己酰亚胺（50μg/ml）在TNF-α（20 ng/ml）存在下孵育1小时，孵育不同时间。随后，用抗Flag抗体和抗HA抗体对细胞提取物进行免疫印迹分析。在其他三个实验中获得了基本相同的结果。
图8
图8
非典型PKCs激活NF-κB需要IKKβ。将100 ngκB荧光素酶报告基因质粒和2μg每个激酶结构转染293细胞的亚流培养物。通过补充控制载体PCDNA3，转染的总DNA量（5μg）保持不变。24小时后，细胞未经处理或在收获前用TNF-α（20 ng/ml）刺激6小时。制备提取物，并按照材料和方法中的描述测定荧光素酶活性水平。结果是三个独立实验的平均值±标准偏差，重复培养。C、 控制；Z、 ζPKC；五十、 λ/λPKC。
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