Endostar对肝癌22荷瘤小鼠肿瘤血管正常化的血管生成参与免疫反应

化学品和试剂

Endostar由Simcere Pharmaceutical Group（中国南京）提供。RPMI-1640培养基和胰蛋白酶由南京科创生物科技有限公司（中国南京）提供。胎牛血清（FBS）购自Gibco（Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）。Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）提供了CD31（分类号ab28364）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α；分类号ab2185）、MMP-2（分类号ab37150）、MMP-9（分类号ab38898）、VEGF（分类编号ab46154）、IFN-γ（分类号ab 198801）、IL-17（分类号ob79056）和CD86（分类号阿布119857）的抗体。小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α；MK1169）、干扰素-γ（MK1205）、白介素-17（MK1445）、甲胎蛋白（AFP；MK2689）和环腺苷5′-磷酸（cAMP；MX2893）ELISA试剂盒由武汉博斯特生物科技有限公司（中国武汉）订购。单克隆β-肌动蛋白抗体（sc-47778）购自圣克鲁斯生物技术公司（美国德克萨斯州达拉斯）。二级抗体（辣根过氧化物酶结合抗抗体IgG）来自Invitrogen（A-11034；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。

细胞培养

小鼠H22细胞系购自中国医学科学院肿瘤研究所（中国上海）。H22细胞在含有10%FBS、80 U/ml青霉素和0.08 mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中培养。细胞在5%CO的培养箱中培养₂和37°C。培养基每隔一天更新一次。用含有0.01%EDTA的0.25%胰蛋白酶分离这些细胞并用于接种。将传代三到四次的细胞用于后续实验。

携带H22的C57BL/6小鼠及其治疗

从上海实验动物中心（中国上海）购买了86只雄性C57B L/6（C57黑6）小鼠，它们的体重为6-8周（18-22克）。所有小鼠均保持在实验动物的清洁标准。小鼠被放置7天以适应环境，并保持在25°C的温度和45%的相对湿度下。动物被安置在江苏省实验动物中心（中国南京），进行12/12小时的光/暗循环，食物和水随意.动物实验方案由江苏省中医药研究院（中国江苏）动物护理与使用机构委员会审查批准。含有H22细胞（1×10）的细胞悬液⁶细胞/ml；0.2 ml）注射到C57BL/6小鼠的肝组织中。然后将H22细胞小鼠随机分为两组，每组40只，连续给药12天。其他6只小鼠设为空白对照。Endostar组每天给予Endostar0.5 mg/kg的剂量。模型组和空白对照组小鼠给予与Endostar等量的生理盐水。在第1天、第3天、第6天、第9天和第12天处死模型组小鼠和Endostar处理的小鼠，并立即切除HCC组织。

苏木精和伊红（H&E）染色

将HCC组织在室温下固定在4%（w/v）多聚甲醛中24 h。使用显微镜载玻片进行冷冻切片或再水化肝组织切片（4µm厚）。在二甲苯中对切片进行脱蜡，并通过降低乙醇浓度进行再水化。将载玻片浸入0.3%H₂O（运行）₂用手搅拌30秒。然后将载玻片浸入装有迈尔苏木精的科普林罐中，并在50°C下搅拌30秒。将载玻片在水中漂洗1分钟，并在30°C搅拌下用1%曙红Y溶液染色10至30秒。接下来，分别用两次95%酒精和两次100%酒精的变化进行30秒的脱水。用二甲苯洗涤两次以提取乙醇。然后加入中性口香糖滴（美国明尼苏达州圣路易斯公园生物世界科技公司），并用盖玻片覆盖。用H&E对肝组织进行染色，并使用数码相机拍摄图像。

ELISA检测免疫学和肿瘤相关因子

用ELISA法测定C57BL/6荷H22小鼠血清或肝癌组织中AFP、cAMP、TNF-α、IFN-γ和IL-17的水平。在无菌条件下从小鼠视网膜静脉获取血液，然后在4°C下以1000×g离心10分钟。通过添加400µl裂解缓冲液裂解HCC组织，该缓冲液含有20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4，1%Triton X-100，150mM NaCl和5mM EDTA(23). 将裂解液置于冰上30 min，涡流混合，并在14000×g、4°C下离心15 min。收集上清液供后续使用。根据制造商的协议进行ELISA。在反应结束时，使用微孔板读取器（SPECTRAmax 19.0；Molecular Devices，LCC，Sunnyvale，CA，USA）在450nm处读取样品的光密度值。

蛋白质印迹

Western blotting检测CD31、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、VEGF、TNF-α、IFN-γ、IL-17和CD86的蛋白表达。在使用Endostar治疗后，用生理盐水清洗模型组小鼠和Endostar-治疗小鼠的肝癌组织。随后，用含有50 mM Tris、1%Nonide P-40和2 mM EDTA、11.5µg/ml抑肽酶、120 mM NaCl、11.5μg/ml亮氨酸肽、100 mM氟化钠、50µg/ml苯甲基磺酰氟和0.2 mM原钒酸钠的冰镇放射免疫沉淀分析缓冲液在4°C下对这些组织进行30分钟的溶解。根据制造商的协议，使用双茚二酸法（Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc.）量化蛋白质浓度。随后，通过12%SDS-PAGE将每个样品中相同数量的蛋白质（50µg）溶解，并转移到聚偏氟乙烯膜上。在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，Germany）封闭膜2 h，在TBS-Tween-20中洗涤三次，并用抗CD31（稀释度，1:1000）、HIF-1α（稀释度：1:500，TNF-α（稀释，1:1000）、IFN-γ（稀释，1:000）、IL-17（稀释，1-1000）、CD86（稀释，1/1000）和β-肌动蛋白（稀释，1/500）在4°C下过夜。随后，在室温下将膜与上述二级抗体（稀释度为1:5000）孵育1小时。最后，用增强化学发光试剂（Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc.）处理蛋白质带以进行可视化。β-actin作为负荷对照。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析

RT-qPCR检测HIF-1α和VEGF的mRNA表达。使用TRIzol试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）提取肝脏样品的总RNA。然后，按照制造商的协议，使用SuperScript III第一链合成系统对其进行逆转录，以进行RT-qPCR。引物如下：HIF-1α正向，5′-AAACCTAAATGTTCTGCCTAC-3′和反向，5′-GGATGTAATAGAGACAAGT-3′；VEGF正向，5′-AGGAAGAGGAGAGAGA-3′，反向，5′-GGCTGTTGTGTGTGT-3′；GAPDH正向，5′-ATGACATCAAGAGGTGGTG-3′，反向，5′-CATACCAGGAAATGTTG-3′。使用Primer Premier 5（Premier Biosoft，加利福尼亚州帕洛阿尔托，美国）选择并构建引物。qPCR使用ABI 7900序列检测器（赛默飞世尔科学公司），使用SYBR Green方法和d（N）进行₆随机六聚体。PCR热循环参数为95°C 10 min，40个95°C循环15 s，60°C循环1 min。GAPDH用作内部竞争参考标准；使用比较Cq（定量循环）方法计算基因表达的相对变化，使用2^-ΔΔCq方法(24). 每个样品一式三份，每个实验重复三次。

免疫组织化学

详细的操作程序如前所述执行(25). 简单地说，用乙醚麻醉小鼠60秒，然后用颈椎脱位处死。取荷瘤肝组织，在室温下用4%新制备的多聚甲醛在0.1 M PBS（pH 7.2）中固定24小时。肝组织用连续梯度浓度的酒精脱水，然后包埋在石蜡块中。将4µm厚的切片切割并贴在特定的载玻片上进行免疫组化。在用分级系列酒精（100、95、80和70%，各2分钟）脱蜡和脱水后，使用3%过氧化氢在室温下阻断内源性过氧化物酶20分钟。在用PBS（pH 7.2）清洗后，用5%的BSA（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）在37°C下处理切片30分钟，以防止非特异性反应。随后，将这些切片与主要抗体孵育，包括抗IL-17（稀释度1:500）、抗CD86（稀释度1:1500）和抗IFN-γ（稀释度：1:500）在4°C下过夜。切片用PBS洗涤三次，然后与前面描述的第二抗体（稀释液，1:1000）在37°C下孵育2小时。最后，切片用3,3′-二氨基联苯胺在室温下染色1分钟。使用奥林巴斯图像采集系统（日本东京奥林巴斯公司）在光学显微镜下放大×200倍（IX71）对切片进行可视化和图像采集，然后使用image-Pro Plus软件6.0（美国马里兰州罗克维尔Media Cybernetics公司）对图像进行分析和量化。PBS被用作主要抗体，以归一化为负荷控制。

统计分析

数据表示为平均值±标准偏差。使用SPSS软件（16.0版；SPSS，Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥），通过基于Student双尾不配对t检验或Dunnett多重比较检验的单向方差分析进行统计分析。Image-Pro Plus软件（6.0版；Media Cybernetics，Inc.）用于处理图像。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。

肝组织病理学观察

治疗5天后，对肝组织进行H&E染色，观察肝组织形态学损伤。如中所示图1AH&E染色显示，与空白对照组小鼠相比，H22细胞注射小鼠（HCC小鼠）的肝组织具有典型的肿瘤细胞基本特征，体积较大，细胞核形状不规则(图1B). 使用Endostar（0.5 mg/kg/天）治疗后，肿瘤细胞的增殖和浸润受到抑制(图1C).

Endostar对H22荷瘤小鼠AFP和cAMP水平的影响

如所示表一与空白对照组（28.19±3.26 ng/ml）相比，大多数肝癌小鼠血清AFP水平显著升高（P<0.05）。AFP水平与治疗时间呈正相关；从第3天到第9天，随着时间的延长，AFP水平逐渐升高。虽然在第12天，Endostar治疗组与模型组之间的AFP水平没有显著差异，但与模型小鼠相比，Endotar治疗后第3天至第9天的血清AFP水平显著降低（P<0.05）。

cAMP以前与HCC有关(26). H22荷瘤小鼠的血清cAMP水平显著降低，从第1天的峰值0.51±0.07 nmol/ml降至第12天的低值0.07±0.01 nmol/ml（P<0.05）。在同一天到第12天，与模型组相比，Endostar治疗导致cAMP水平显著升高(表一). 因此，假设Endostar在第3天至第9天给药后可提高H22荷瘤小鼠的AFP和cAMP水平，这意味着有效工作时间持续6天。

Endostar对不同治疗时间肝组织血管生成相关蛋白的影响

为了筛选最佳归一化窗口，研究了Endostar在不同治疗时间（包括第1、3、6、9和12天）对肝组织血管生成相关蛋白表达的影响。与空白小鼠相比，模型组VEGF、CD31、HIF-1α、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平显著增加，随后随着时间的推移，蛋白表达水平逐渐增加。值得注意的是，Endostar治疗组这些蛋白的表达显著降低（P<0.05；图2A).

在Endostar治疗组中，与前一天相比，第二天VEGF显著降低（第6天与第3天相比，以及第9天与第6天相比；P<0.05）。然而，VEGF水平在第12天逆转上升(图2B). 从第3天到第9天，与前几天相比，Endostar治疗显著降低了肿瘤内微血管密度（MVD）的指标CD31的水平（P<0.05；图2C)而HIF-1α、MMP-2和MMP-9在第9天显著下调（P<0.05；图2D-F). 值得注意的是，Endostar治疗组的血管生成相关蛋白，包括VEGF、CD31、MMP-2和MMP-9的表达水平与模型组相比显著降低（P<0.05），但与空白对照组相比没有显著差异。这些结果表明，第3至9天可能是Endostar治疗的最佳归一化窗口。

Endostar对肝癌小鼠肝组织HIF-1α和VEGF mRNA水平的影响

为了证实上述结果，采用RT-PCR测定了肝癌组织中HIF-1α和VEGF的mRNA水平。如中所示图3A与空白对照组相比，模型组第3天HIF-1αmRNA水平显著升高（P<0.05）。经Endostar治疗后，HIF-1αmRNA水平与模型组相比显著降低（P<0.05）。VEGF mRNA水平也表现出类似的趋势(图3B). 对于内皮素治疗组的HIF-1α和VEGF mRNA水平，HIF-1βmRNA水平在第3、6和9天显著降低（P<0.01），而VEGF的mRNA水平则在第9天降低（P<0.001）。这些结果还表明，第3至9天可能是Endostar的最佳血管正常化窗口。

Endostar对肝癌小鼠肝组织TNF-α的影响

免疫因子参与肝癌的血管生成并有助于血管正常化(27). TNF-α是一种炎症细胞因子，已被证明与HCC相关(28). 模型组的肝脏TNF-α水平随着时间的增加而逐渐增加，并从第1天的0.95±0.12 pg/mg的低水平分别增加到第3、6、9和12天的3.51±0.91、5.36±0.74、7.18±0.71和7.31±0.13 pg/mg(表一). 给药后第3~9天，TNF-α水平显著降低（P<0.05）。

Endostar对肝癌小鼠肝组织IFN-γ、IL-17和CD86的影响

为了探讨Endostar对肝癌小鼠血管生成的影响，于第6天检测肝组织中免疫因子IFN-γ、IL-17和CD86的水平。模型组IFN-γ和CD86水平明显低于空白对照组（P<0.01）。免疫组织化学结果(图4A)，ELISA(图4B)或western blotting(图4C和D)表明Endostar能够增强降低的IFN-γ水平（P<0.01）。第个结果，共个图5显示Endostar能够增强降低的CD86水平（P<0.01）。对于IL-17，在模型组中观察到显著降低，而通过Endostar治疗，这种降低更为明显(图6). 这些结果表明，免疫调节因子参与了肝癌小鼠的血管生成，Endostar能够通过调节这些因子促进血管正常化。