摘要 转化生长因子-β（TGF-β）是一种与伤口愈合和肺纤维化发病机制有关的细胞因子。 TGF-β刺激肌成纤维细胞分化，其特征是可收缩平滑肌（SM）特异蛋白的表达，如SM–α-肌动蛋白。 在本研究中，我们检测了血清反应因子（SRF）在TGF-β诱导人肺成纤维细胞（HLF）肺肌成纤维细胞分化机制中的作用。 TGF-β刺激HLF中SM–α-actin的表达，这与SRF表达和活性的深刻诱导平行。 药物性SRF抑制剂（CCG-1423）或通过腺病毒介导的SRF短发夹RNA（shSRF）转导抑制SRF，阻断SRF和SM–α-actin对TGF-β的反应表达，而不影响Smad介导的TGF-α信号传导。 然而，SRF自身的强制表达并不能促进SM–α-actin的表达，而组成性反式激活SRF融合蛋白（SRF-VP16）的表达足以诱导SM–α-actin表达，这表明SRF的表达和反式激活都很重要。 forskolin或iloprost激活蛋白激酶A（PKA）可显著抑制TGF-β诱导的SM–α-actin表达，这与抑制SRF表达和活性有关，但与Smad介导的基因转录无关。 总之，这是第一次直接证明TGF-β诱导的肺肌成纤维细胞分化是由SRF介导的，PKA通过下调SRF表达水平和SRF活性来抑制肌纤维细胞分化，而不依赖于Smad信号。
关键词： 转化生长因子-β、血清反应因子、肌成纤维细胞、蛋白激酶A、Smad
临床相关性 本研究证明血清反应因子在转化生长因子-β介导肺肌成纤维细胞分化中的重要作用。 抑制血清反应因子可能是治疗肺纤维化的一种有用策略。
特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性、致命性疾病，其特征是肺实质纤维化和肺结构变形。 目前还没有有效的治疗方法，需要确定药物干预的新靶点。 肺泡成纤维细胞在转化生长因子（TGF）-β的刺激下，通过改变其基因表达谱作出反应 从头开始的 平滑肌细胞中常见的细胞骨架和收缩蛋白的表达( 1 , 2 )导致成纤维细胞和平滑肌细胞之间处于中间状态的表型，称为 肌成纤维细胞 ( 三 , 4 ). 平滑肌（SM）–α-肌动蛋白是一种并入应激丝的收缩蛋白，是肌成纤维细胞分化的公认标志。
TGF-β，一种与实验性肺纤维化和人类疾病发病机制相关的细胞因子( 5 – 8 )是一种成熟的肌成纤维细胞分化诱导剂。 在细胞水平上，已知TGF-β通过跨膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶发出信号，磷酸化并激活其 规范的 信号中间体，受体激活的Smad蛋白（Smad2/3），导致它们与共同介导物Co-Smad（Smad4）异源三聚体化，复合物的核积累，以及Smad-binding元件（SBE）的激活，这些元件调节靶基因的转录( 9 , 10 ). 先前对培养的肺成纤维细胞的研究表明，SBE在介导TGF-β诱导的SMα-actin启动子激活中起作用( 11 – 13 )而其他人则暗示TGF-β控制元件（TCE）由Sp1/3转录因子激活并由Kruppel-like因子调节( 14 – 16 ). 此外，研究表明，cAMP升高激动剂前列腺素E2可在不影响Smad信号的情况下，减弱TGF-β诱导的肺肌成纤维细胞分化( 17 , 18 ).
在血管平滑肌细胞（VSMC）中，SM-gene转录主要通过血清反应因子（SRF）与其靶点的结合来控制 顺式 -元件，CArG盒（CC（AT） 6 大多数SM基因启动子区域内的GG）( 19 ). SRF激活通常由G蛋白偶联受体激动剂（如内皮素-1）诱导( 20 )如前所述，它是VSMC中SM基因表达的强大刺激物( 21 ). 此外，我们还发现，在VSMC中，SRF活性对蛋白激酶A（PKA）的调节高度敏感( 21 ). 然而，SRF在TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化中的作用尚不清楚。 利用小鼠SM–α-肌动蛋白启动子CArG突变的前期研究( 16 )或诱饵CArG寡核苷酸( 22 )，并不表明肺成纤维细胞中TGF-β诱导的SM-actin转录对CArG的绝对需求。 这些数据与大鼠成纤维细胞系中TGF-β激活SM–α-actin表达的CArG需求的证据形成对比( 23 ).
鉴于这些相互矛盾的观察结果，我们试图( 1 )使用药理学和siRNA方法检查SRF在TGF-β诱导的肺肌成纤维细胞分化中的作用，以及( 2 )测试PKA对SRF的调节是否可以解释cAMP提升剂对TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化的抑制。
材料和方法 人肺成纤维细胞的分离和原代培养 从接受肺纤维化肺移植患者的移植肺中获取组织样本，并将其置于Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。 将有肺泡的肺切碎，在PBS中清洗，然后在含有补充有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml链霉素、250 ng/ml两性霉素B和100 U/ml青霉素的DMEM的生长培养基中，将其置于10-cm的平板上。 扩大的成纤维细胞群体随后在4-5天后进行继代培养，从而形成均质成纤维细胞群。 从第5-10代开始使用所有原代培养物，并在塑料上生长。 在所有实验中，细胞在含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM中隔夜剥夺血清，然后用激动剂刺激。
瞬时DNA转染和腺病毒介导的基因转导 按照标准制造商的方案，使用LipofectAMINE PLUS试剂（Invitrogen）进行瞬时DNA转染。 如前所述，腺病毒介导的基因转导是通过在含有0.1%BSA的培养基中培养含有所需腺病毒（每个细胞100个噬菌体形成单位[pfu]）的细胞来实现的( 24 ).
DNA和其他试剂 野生型SRF的质粒由Julian Solway博士（伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学）提供。 构成活性SRF-VP16嵌合蛋白的质粒，其中SRF的C末端反激活域被病毒共激活物VP16的反激活域取代( 25 )和嵌合蛋白GAL4-VP16的质粒是Joseph Miano博士（纽约州罗切斯特市罗切斯特大学）赠送的礼物。 大鼠−764碱基对SM–α-actin启动子的萤火虫荧光素酶报告子是Sem Phan博士（密歇根大学，密歇根州安娜堡）赠送的一份礼物，如前所述( 13 ). 之前使用了由两份CArG元件（SRF-Luc）驱动的萤火虫荧光素酶报告器( 21 , 26 – 28 ). 由四份Smad-binding元件（SBE-Luc）拷贝驱动的萤火虫荧光素酶报告器由Bert Vogelstein博士提供，之前曾使用过( 24 ). 胸腺嘧啶激酶启动子（TK）驱动肾小球荧光素酶的质粒来自普罗米加（威斯康星州麦迪逊）。 表达针对SRF的短发夹RNA的重组缺陷型腺病毒（Ad-shSRF），或表达针对GFP的shRNA的对照腺病毒（Ad-shGFP），由Joseph Miano博士（罗切斯特大学）提供，如前所述( 29 ). CCG-1423来自Cayman Chemical（密歇根州安阿伯）。 抗-VASP抗体和TGF-β来自EMD Biosciences（新泽西州吉布斯敦）。 Forskolin（FSK）来自Fisher生物试剂公司（新泽西州Fair Lawn）。 β-actin和SM–α-actin抗体来自Sigma（密苏里州圣路易斯）。 SRF和Smad4抗体来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。 磷化Smad2和Smad2抗体来自细胞信号（Danvers，MA）。
西方印迹法 用所需的激动剂刺激静止细胞后，在含有25 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、1%Triton X-100、0.1%SDS、2 mM EDTA、2 mM-EGTA、10%甘油、1 mM NaF、200μM Na-甲氧钒酸钠和蛋白酶抑制剂（1μg/ml亮氨酸肽、1μg/ml抑肽酶、1 mM-PMSF）的RIPA缓冲液中溶解细胞。 通过以20000× 克 10分钟，在Laemmli缓冲液中煮沸，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，用0.5μg/ml一级所需的一级抗体进行Western blotting分析，然后用1:3000稀释的HRP-结合二级抗体（EMD）进行分析，并通过增强化学发光（ECL）反应进行开发（Pierce，Rockford，IL）。
荧光素酶报告分析 在24孔板中培养次级流入细胞，并与期望的萤火虫荧光素酶报告质粒（500 ng/ml）和20 ng/ml TK共同转染- 雷尼利亚 荧光素酶质粒。 将细胞放置在生长培养基中过夜，然后饥饿血清24小时，然后用所需的激动剂刺激相关时间。 然后用磷酸盐缓冲盐水清洗细胞，并在蛋白提取试剂中溶解。 对裂解液进行萤火虫和 雷尼利亚 使用Promega Dual荧光素酶分析试剂盒（Promega）的荧光素素酶活性。 为了解释转染效率的差异，将每个样本的萤火虫荧光素酶活性标准化为 雷尼利亚 荧光素酶活性。
统计分析 所有数据都代表了至少三个独立实验的结果。 学生分析了定量数据 t吨 测试和值 P（P） <0.05被认为具有统计学意义。
结果 图1A 显示TGF-β在血清缺乏的人肺成纤维细胞中深度诱导SM–α-actin表达，而管家β-actin无变化，表明肌成纤维细胞分化。 有趣的是，SRF被认为是普遍表达的，在静息状态下的肺成纤维细胞中有极低的表达，但其表达是由TGF-β以类似于SM–α-肌动蛋白诱导的时间过程深度诱导的。 在这方面，静止的肺成纤维细胞与血管平滑肌细胞截然不同，后者在基础状态下大量表达SRF（数据未显示）。 重要的是，TGF-β诱导的SRF表达与SRF活性的增加有关，由两个CArG元件驱动的SRF-荧光素酶报告子进行评估( 图1B ). 这表明TGF-β可能通过以下途径刺激SRF-依赖性基因转录( 1 )上调SRF表达和( 2 )刺激SRF反式激活。
图1。
转化生长因子（TGF）-β诱导的平滑肌（SM）-α-肌动蛋白的表达伴随着血清反应因子（SRF）的表达和激活。 ( 一 )将人肺成纤维细胞生长至低通量，血清饥饿过夜，并用2 ng/ml TGF-β刺激指定的时间。 用所示的抗SM–α-actin、SRF或β-actin抗体对细胞提取物进行Western blotting分析。 ( B类 )将亚流入的人肺成纤维细胞转染SRF-萤火虫荧光素酶报告子（SRF-luc）、胸腺嘧啶激酶驱动的肾小球荧光素素酶（TK-RL）对照报告子和血清饥饿过夜，然后用载体（C）或2 ng/ml TGF-β刺激24小时。 然后，在细胞裂解液中测量萤火虫荧光素酶（SRF-Luc）的活性，并将其归一化为肾小球荧光素酶（TK-RL）的活性。 数据表示三次实验的结果，一式三份。
为了检测是否需要SRF来表达SM–α-actin以响应TGF-β，我们首先使用了最近描述的SRF药物抑制剂CCG-1423( 30 ). 如所示 图2A CCG-1423预处理可完全抑制TGF-β诱导的SM-α-actin表达。 CCG-1423还抑制SRF蛋白的表达以响应TGF-β，这与之前报道的SRF在诱导自身基因转录中的作用一致( 31 , 32 ). 相反，CCG-1423不影响Smad2、Smad4或β-actin的表达( 图2A )TGF-β诱导Smad2磷酸化的nor( 图2B )表明CCG-1423对TGF-β诱导的SMα-actin表达的调节独立于典型的Smad信号。
图2。
药物性SRF抑制剂CCG-1423下调SM–α-actin和SRF表达。 ( 一 )用10μM CCG-1423预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞1小时，然后用2 ng/ml TGF-β刺激48小时。 通过Western blotting分析细胞提取物，并根据指示使用针对SM–α-actin、SRF、Smad2、Smad4或β-actin的抗体。 ( B类 )用10μM CCG-1423预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞1小时，然后用2 ng/ml TGF-β刺激指定时间。 通过Western blotting分析细胞提取物与抗磷酸化S-mad2（Ser465/Ser467）、总Smad2或β-肌动蛋白的抗体。
为了进一步研究SRF对SM–α-肌动蛋白表达的潜在需求，我们通过腺病毒介导的针对SRF的短发夹RNA（Ad-shSRF）的表达，使用了SRF敲除方法。 如所示 图3 在不影响Smad2、Smad4或β-actin表达的情况下，用Ad-shSRF而非对照Ad-shGFP转导人肺成纤维细胞可有效抑制SRF表达。 重要的是，SRF的敲除与TGF-β对SM–α-actin表达的完全抑制有关。 结果显示在 图2 和 三 强烈建议SRF的表达和/或活性是TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化所必需的。
图3。
SRF敲除下调SM–α-actin表达。 用表达抗SRF短发夹RNA的重组缺陷型腺病毒（Ad-shSRF）或在0.1%牛血清白蛋白中表达抗GFP短发夹病毒（Ad-shGFP）的对照腺病毒转导亚流入的人肺成纤维细胞48小时，然后用2 ng/ml TGF-β刺激细胞48小时。 通过Western blotting分析细胞提取物与SRF、SM–α-actin、Smad2、Smad4或β-actin抗体，如图所示。
给定TGF-β对SRF和SM–α-actin的平行诱导( 图1 )以及SM–α-actin表达对SRF的依赖性，以响应TGF-β( 图2 和 三 )，我们试图确定SRF的强制过度表达是否足以驱动SM–α-actin的表达。 由于DNA转染原代培养的人肺成纤维细胞的局限性，我们使用HT-1080纤维肉瘤细胞系，该细胞系允许高效的瞬时转染，并且在基础状态下也表达低水平的SRF。 为了区分内源性和异位性SRF，我们使用GFP标记的SRF cDNA。 如所示 图4 ，GFP-SRF的异位表达未能增加HT-1080细胞中SM–α-actin蛋白的水平。 相反，组成活性嵌合蛋白SRF-VP16的表达，其中SRF的C末端转录激活域被病毒共激活物VP16的转录激活域取代( 25 )，诱导SM–α-actin表达( 图4 ). SRF-VP16的这种作用是SRF特有的，因为GAL4-VP16嵌合蛋白的表达（包含VP16的转录激活域，但不包含GAL4 DNA结合域，该结合域不与SRF靶向顺式元件CArG盒相互作用）不会诱导SM–α-actin的表达( 图4 ). 这些数据表明，SRF自身的表达不足以表达SM–α-actin，但也需要SRF的反激活。 有趣的是，尽管SRF-VP16能有效促进SM–α-actin的表达，但它并没有显著诱导内源性SRF的表达( 图4 )这表明SRF基因转录可能需要其他机制。
图4。
SRF过表达本身不足以驱动SM–α-肌动蛋白的表达。 用空白载体或对照载体cDNA（pcDNA3.1）、GFP标记的野生型SRF、组成活性SRF-VP16融合蛋白或GAL4-VP16融合蛋白质转染HT-1080细胞48小时。 如图所示，用抗SRF、SM–α-肌动蛋白或β-肌动蛋白的抗体通过蛋白质印迹分析细胞提取物。 注意，针对SRF C末端的SRF抗体不能识别SRF-VP16，因为SRF的C末端反激活域被病毒共激活物VP16的反激活域所取代( 25 ).
我们以前曾报道过，G蛋白偶联激动剂（如内皮素-1或细胞外ATP）诱导的SRF活性和SMα-肌动蛋白表达对蛋白激酶A（PKA）在血管平滑肌细胞中的调节高度敏感( 21 , 26 ). 因此，我们研究了PKA是否调节TGF-β诱导的人肺成纤维细胞中SRF和SM–α-actin的表达。 图5A 表明，通过腺苷酸环化酶激活剂FSK刺激PKA，可深度抑制TGF-β诱导的人肺成纤维细胞SRF和SMα-actin的表达，而对β-actin表达无影响。 FSK对TGF-β诱导的Smad2磷酸化没有影响( 图5B )而其在PKA激活中的有效性通过PKA底物、血管扩张剂刺激的磷酸蛋白VASP的磷酸化得到证实( 33 )，由磷酸化VASP的电泳迁移率变化确定( 图5B )，由PKA介导( 21 ). 此外，稳定的前列环素类似物伊洛前列素通过前列腺素受体发出信号，激活PKA( 34 )对TGF-β诱导的SMα-actin和SRF表达具有类似的抑制作用( 图5C ).
图5。
cAMP提剂抑制TGF-β诱导的SMα-actin和SRF表达。 ( 一 )用10μM forskolin（FSK）预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞15分钟，然后用2 ng/ml TGF-β刺激48小时。 采用免疫印迹法对细胞提取物进行分析，并根据指示使用抗SRF、SM–α-actin或β-actin抗体。 ( B类 )用10μM FSK预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞15分钟，然后用2 ng/ml TGF-β刺激30分钟。 通过Western blotting分析细胞提取物与磷酸化S-mad2（Ser465/Ser467）、总Smad2、血管扩张剂刺激的磷酸蛋白（VASP）或β-肌动蛋白的抗体。 VASP的电形态迁移率随其被PKA磷酸化而发生变化( 21 ). ( C类 )用10μM Iloprost（Ilo）预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞15分钟，然后用2 ng/ml TGF-β刺激48小时。 采用免疫印迹法对细胞提取物进行分析，并根据指示使用抗SRF、SM–α-actin或β-actin抗体。
为了进一步明确PKA对SM–α-actin表达的转录控制，我们使用了包含SRF结合位点（CArG盒）和SBE的SM–α-actin启动子（-764碱基对）荧光素酶报告子( 13 ). 如所示 图6A ，TGF-β诱导荧光素酶活性的3倍诱导，FSK处理可消除这种诱导。 这表明PKA对SM–α-actin表达的调节发生在基因转录水平。 此外，FSK阻断了TGF-β诱导的由两个CArG元件驱动的SRF-荧光素酶报告子的激活( 图6B )，不影响TGF-β对SBE-荧光素酶报告子的激活( 图6C ). 总之，这些数据强烈表明，PKA通过抑制SRF表达和活性而抑制TGF-β诱导的SMα-actin表达，但不抑制Smad依赖性基因转录。
图6。
PKA通过抑制SRF而非Smad-binding elements（SBE）来调节TGF-β诱导的SMα-actin启动子激活。 用荧光素酶报告子转染人肺成纤维细胞，获得−764碱基对( 一 )SM–α-肌动蛋白启动子( B类 )SRF萤光素酶报告基因，或( C类 )SBE-荧光素酶报告子和胸腺嘧啶激酶驱动肾小球（TK-RL）对照报告子。 用10μM FSK预处理血清饥饿细胞15分钟，然后用2 ng/ml TGF-β刺激24小时。 然后在细胞裂解液中测量荧光素酶的活性，并将其归一化为肾小球的活性。 数据表示至少三次实验的结果，一式三份(* P（P） < 0.05).
讨论 我们研究的第一个重要观察结果是，TGF-β刺激肺成纤维细胞可导致SRF表达的深刻诱导( 图1 ). 在缺乏血清的条件下，SRF的水平相对较低，但在用TGF-β治疗24至48小时后，SRF表达被诱导到更典型的静止平滑肌细胞水平。 这种上调在时间上与SM–α-actin表达的诱导相关，表明这两种事件之间存在联系。 我们的观察结果与之前的一致 体内 使用博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠模型进行的研究，在该模型中，SRF表达增加，同时诱导SM–α-actin阳性肌成纤维细胞( 35 ).
TGF-β诱导SRF表达的机制存在多种可能性，包括转录调控。 Spencer和Misra的SRF启动子突变研究( 31 )建立了血清诱导SRF的CArG依赖性。 我们的数据表明，在HT1080细胞中，通过过表达SRF-VP16而分离的SRF反式激活对内源性SRF的表达影响微乎其微，同时诱导了SM–α-actin表达的深刻诱导( 图4 ). 这些数据和其他研究的结果表明，SRF转录可能需要其他机制，包括Sp1、Egr-1和CCAATT结合元件( 32 ). 鉴于TGF-β可以招募Sp1( 16 )，TGF-β对SRF的初始转录可能通过Sp1发生。 另一方面，对SRF基因5′非翻译区的分析很有可能预测在CArG盒上游存在假定的SBE（我们的未发表的观察结果），这表明TGF-β也可以为SRF启动子激活招募典型的Smad信号。 因此，TGF-β（不一定通过CArGs）对SRF表达的初始诱导可能随后通过新合成（和反式激活）的SRF以正反馈方式驱动SRF启动子。 最后，翻译后调节也可能发挥作用，因为在我们的附加实验中，在暴露48小时后去除TGF-β导致SRF蛋白的消失速度比SM–α-肌动蛋白的消失快得多，这表明SRF不太稳定。 同样，Misra及其同事观察到SRF的广泛磷酸化( 36 )，这可能会影响其稳定性。 我们实验室目前正在调查这些可能性。
本研究的第二个重要结论是TGF-β诱导的肺肌成纤维细胞分化依赖于可诱导的SRF表达( 图2 和 三 ). 然而，使用HT-1080纤维肉瘤细胞系，我们还发现SRF表达本身不足以诱导SM–α-actin，并且需要SRF反激活( 图4 ). 虽然将癌细胞系的结果外推到从原代培养获得的结果时要谨慎，但我们选择使用HT1080细胞系来促进SRF和SRF-VP16转染到足够百分比的细胞中，以评估其功能效果。 第二，虽然它不能再现分化肌成纤维细胞的某些表型特征（低增殖能力），但它确实是研究诱导收缩基因表达和SRF表达的有用模型，因为它在基础状态下保持这些蛋白的低水平， 类似于人肺成纤维细胞的原代培养。
血清或G蛋白偶联受体激活SRF的公认机制涉及RhoA激活和肌动蛋白动力学的调节( 37 – 39 ). 公布的数据表明RhoA的作用( 40 )在介导TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化中，我们已使用特定的Rho激酶抑制剂证实了这一点（数据未显示）。 考虑到TGF-β诱导的SRF和SMα-actin激活的延迟效应( 图1A )也可能存在需要合成和释放其他介质的中间步骤。 1-磷酸鞘氨醇，对TGF-β产生反应( 40 )已知能刺激RhoA和SRF( 41 )可能就是这样一个调解人。 其他潜在机制可能包括TGF-β诱导的Smad3/SRF相互作用( 12 )，或抑制Smad7和SRF之间的相互作用减弱( 42 ).
最后，我们的数据表明，SRF可能是负调控肺成纤维细胞分化的重要靶点，这可能具有潜在的治疗重要性。 其他研究人员已经表明，PGE2通过cAMP的升高诱导其抗纤维化作用，这种作用独立于Smad信号( 17 , 18 ). 我们的观察结果还表明，通过cAMP升高（FSK和iloprost）发出信号的药物对SM-α-actin表达的Smad依赖性调节，更重要的是，这是通过抑制SRF实现的( 图5 , 6 ). cAMP抑制SRF活性的机制尚不完全清楚。 我们以前的研究表明，cAMP通过激活蛋白PKA抑制VSMC中的SRF活性( 21 , 26 ). 众所周知，PKA可以磷酸化RhoA( 43 )，提示通过抑制RhoA调节SRF的潜在机制。 第二，我们之前的结果( 21 )并呈现数据( 图5B )显示PKA对血管扩张剂刺激的磷酸蛋白（VASP）的磷酸化。 鉴于VASP促进肌动蛋白聚合和SRF活化( 44 )鉴于磷酸化VASP不能结合肌动蛋白丝( 45 )VASP可以为PKA对SRF的调控提供额外的机制。 第三，SRF本身可以被PKA磷酸化( 46 )可能表明PKA对SRF有直接调节作用。 最后，cAMP最近被证明可以刺激cAMP激活的交换蛋白Epac( 47 )也可能调节肌成纤维细胞的纤维化特征，如胶原合成( 48 )，和增殖( 49 , 50 )表明cAMP可能对SRF和/或SM–α-actin表达进行PKA非依赖性调节。 我们实验室正在研究这些可能性。
致谢 作者感谢Julian Solway博士（芝加哥大学）、Joseph Miano博士（罗切斯特大学）、Sem Phan博士（密歇根大学）和Bert Vogelstein博士（约翰·霍普金斯大学）提供DNA和腺病毒试剂。
本研究得到了美国国立卫生研究院HL071755（给N.O.D.）和美国心脏协会博士后奖学金AHA 0520109Z（给N.S.）的支持。
最初作为DOI:10.1165/rcmb.2008-0288OC出版于2009年1月16日
利益冲突声明 : 作者中没有一人与对本手稿主题感兴趣的商业实体有财务关系。
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美国呼吸细胞和分子生物学杂志的文章由以下网站提供 美国胸科学会
