TGF-β信号缺失促进前列腺癌转移¹

转基因小鼠的产生和基因分型

低压断路器-标签将大鼠LPB基因的5′-侧翼区域（-10834至+28bp）与标签基因缺失突变体(2005年1月)去除了小t抗原的表达[12]. CD1小鼠株中保持了12T-7f和12T-10株系。MT-DNIIR转基因小鼠（MT-DNIIR-27）是使用截短的人类TβRII（Flag表位为挪威船级社MT启动子控制下的转基因[15]. 本研究中使用的MT-DNIIR系在B6D2小鼠株中保持不变。第12T-7fT页^标签+/-雌性与MT-DNIIR交配^{DNIIR公司+/+}雄性小鼠在相似的小鼠背景下产生12T-7f/MT-DNIIR和MT-DNIIR小鼠。12T-7f/MT-DNIIR和MT-DNIIR小鼠在饮用水中补充25 mM硫酸锌以增强转基因表达。第12T-7f页^标签+/-雌性与B6D2F1雄性交配，以在相同的小鼠背景下产生对照12T-7f和非转基因（NT）小鼠。一些对照12T-7f和NT小鼠在饮用水中补充25 mM硫酸锌。第12页，第10页^标签+/+雌性与MT-DNIIR交配^{挪威船级社+/+}雄性小鼠产生12T-10/MT-DNIIR小鼠。为了控制遗传背景，12T-10^标签+/+雌性与B6D2F1雄性交配产生12T-10小鼠。12T-10/MT-DNIIR或12T-10小鼠均未在饮用水中补充25 mM硫酸锌。小鼠的基因型为挪威船级社用蛋白酶K消化和乙醇提取法对小鼠尾部基因组DNA进行聚合酶链反应（PCR）转基因分析。正向TβRII引物（5′-TCCACCGCACGTTCAGAAG-3′）和反向Flag引物（5′-ATCGTCATCGTCTTTGTAGTC-3′）产生一个506bp的扩增子[15]. 小鼠的基因型为标签使用正向LPB引物（5′-TAGCATCTTGTTCTTAGTCTT-3′）和反向LPB引物通过PCR分析转基因标签引物（5′-CTCCTCTCAAGACCTAGAGGTCCA-3′）产生430 bp的扩增子[12]. 内源性小鼠酪蛋白基因的外显子7是标签使用正向酪蛋白引物（5′；-GATGTGCTCCAGGCTAAAGTT-3′）和反向酪蛋白引子（5′，-AGAAACGGAATGTTGGAGT-3′）进行PCR反应，生成540-bp扩增子[12].

组织制备和组织病理学分析

根据范德比尔特大学动物护理委员会的政策，小鼠在吸入麻醉剂后因颈椎脱位而死亡。在解剖显微镜下，前列腺通常被解剖成四个不同的叶（腹叶、侧叶、背叶和前叶）。当无法分离侧叶和背叶时，这些组织被视为背外侧叶。同时采集精囊、输精管、睾丸、尿道旁腺、膀胱、球部尿道腺、主动脉旁淋巴结、颈部淋巴结、腰椎、肝、肺、肾、脾、脑、肾上腺、腮腺和颌下腺进行组织学检查。组织要么在干冰上冷冻并储存在-80°C下，要么固定在10%福尔马林中，然后使用标准技术进行处理并嵌入石蜡中。于上午5点切割石蜡层组织，切片用于H&E染色、免疫组织化学和就地杂交。两位病理学家（S.B.S.和R.L.R.）根据国家癌症研究所人类癌症小鼠模型联合会前列腺病理委员会的组织病理学定义，以盲法对组织学进行分类[17].

免疫组织化学

在5µm厚的石蜡切片上进行免疫染色，石蜡切片用标准技术脱蜡并重新水化[13]. 使用了以下主要抗体（PBS中指示的稀释液）：（a）SV40标签，Ab-2（1:100；致癌研究产品，马萨诸塞州波士顿）；（b） CG，牛SP-1（1:1000；迪亚索林，静水，明尼苏达州）；和（c）TGF-β1，sc-146（1:200；加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。对于标签-免疫染色切片中，使用相同浓度的对照小鼠腹水（西格玛，圣路易斯，密苏里州）作为阴性对照。对于CG-免疫染色切片，使用相同浓度的正常兔免疫球蛋白X903（Dako，Carpintia，CA）作为阴性对照。对于TGF-β1-免疫染色切片，以10倍于一级抗体浓度的对照肽（sc-146P）与一级抗体一起加入作为阴性对照，或使用相同浓度的正常兔免疫球蛋白作为阴性对照。用3,3′-二氨基联苯胺四氯化物（Dako）进行显色。玻片用苏木精复染，脱水，盖玻片。使用MetaMorph图像分析程序对部分免疫染色进行量化。

DNIIR原位杂交

现场杂交是在5µm厚的石蜡切片上进行的，石蜡切片用标准技术脱蜡并重新水化[15]. 将切片杂交到³⁵S标记的正、反义核糖探针。MT-DNIIR质粒用线性化生态RI，用T7聚合酶制备反义探针。传感探头由Xba公司I线性化质粒和T3聚合酶。将载玻片暴露于4°C的感光乳剂中1个月，然后用D19显影剂显影，在1%乙酸中固定，并在30%硫代硫酸钠中清除。切片用0.2%甲苯胺蓝复染。柯达Ektachrome胶片（伊士曼柯达，纽约州罗切斯特）用于使用显微镜（蔡司，纽约州桑伍德）在相位对比、亮场和暗场照明下拍摄照片。

定量实时逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）

使用RNeasy Midi试剂盒75144从冷冻样品中提取RNA，包括用DNase 79254（Qiagen，Valencia，CA）处理。根据分光光度计上的吸光度测定RNA浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA质量。挪威船级社使用Lightcycler荧光温度快速空气循环器（印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司）和cDNA标准曲线以及双链DNA结合荧光探针SYBR Green测定拷贝数。该cDNA模板由MT-DNIIR质粒产生。前锋挪威船级社引物（5′；-AGAAGAATAAACACCACAATCC-3′）和反向挪威船级社引物（5′；-ATCCAACGCGGTAGAGTAGAAGA-3′）产生了一个128-bp的扩增子。熔融曲线分析证实了扩增子在每个反应中的特异性。使用Lightcycle软件（3.5版），根据系列稀释（1:10）标准曲线（10）计算mRNA的拷贝数⁹-10^三副本）。使用七点分析的拟合点法，将连续稀释的标准品与未知样品同时放大，以生成线性标准曲线。此外，使用cDNA模板、正向β-肌动蛋白引物（5′；-ACGCCAGGTCATCACTATTG-3′）和反向h-肌动蛋白引物（5′；-ATGTACTCAGGCCGGGGA-3′），开发了β-肌动蛋白的实时RT-PCR作为负载对照。

Western Blot和条带定量

通过在RIPA缓冲液（PBS，pH 7.4，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）中对冷冻组织进行超声和离心提取蛋白质，该缓冲液补充有1 mM PMSF和完整的迷你蛋白酶抑制剂混合物，1836153（德国曼海姆罗氏）。蛋白质浓度通过Lowry方法使用Bio-Rad蛋白质分析500-0006测定（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）。蛋白质裂解物用β-巯基乙醇处理，并在70°C下加热10分钟，然后在NuPage 7%Tris-醋酸盐凝胶EA035A（Invitrogen，Carlsbad，CA）中电泳。蛋白质在30 V下过夜转移到Invitrolon PVDF膜LC2005（Invitrogen）。在含有0.1%吐温的TBS中，用含有5%脱脂牛奶的封闭缓冲液封闭膜。对于PAII检测，使用封闭缓冲液中1:1000稀释度的抗PAI-I多克隆抗体TP223（Torrey Pines Biolaboraties，Houston TX），然后使用1:2000稀释率的辣根过氧化物酶相关抗兔Ig NA9340（Amersham Biosciences，Beckinghamshire，England，UK）。使用ECL加RPN2132（Amersham Biosciences）和Kodak BioMax MR Film 870-1302（Eastman Kodak）对条带进行可视化。

为了进行′-肌动蛋白检测，在70°C下，通过在剥离缓冲液（2%SDS，62.5 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mMβ-巯基乙醇）中培养30分钟，剥离PAI-I西部膜。然后用单克隆抗β-肌动蛋白抗体A5441（Sigma）在1:5000的封闭缓冲液中封闭并探测细胞膜，然后用1:2000稀释度的辣根过氧化物酶连接的抗鼠Ig NA931V（Amersham Biosciences）在封闭缓冲液里探测细胞膜。使用ECL+RPN2132和柯达BioMax MR胶片870-1302对带状物进行可视化。

为了进行波段定量，对曝光的胶片进行扫描，以在Adobe Photoshop中获得TIFF图像。对于每个膜图像，使用Scion图像分析程序（Scion，Frederick，MD）测量恒定区域中的带强度。将带强度值传输至Microsoft Excel程序进行统计分析。

统计分析

异链酶t吨-通过测试比较两组的Western blot数据。采用Fisher精确检验和广义线性模型（Logistic回归模型）比较两组的转移数据。P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。这些分析是与范德比尔特癌症中心生物统计共享资源合作进行的。

转基因小鼠的制备与鉴定

12T-7f系是杂合的标签转基因，而12T-10系是纯合的标签转基因。MT-DNIIR系是纯合的挪威船级社转基因。因此，12T-7f小鼠与MT-DNIIR小鼠杂交产生12T-7f/MT-DNIIR后代和MT-DNIIR对照后代。12T-7f小鼠与B6D2F1小鼠杂交产生12T-7f对照后代和NT后代。12T-10小鼠与MT-DNIIR小鼠杂交产生12T-10/MT-DNIIR小鼠。将12T-10小鼠与B6D2F1小鼠杂交，产生12T-10对照后代。利用从小鼠尾部分离的基因组DNA，通过PCR对后代进行基因分型(箭头,图1,一和B类).

前列腺的组织学检查显示，在表达T抗原的小鼠中，前列腺发生了进行性肿瘤，但在其他小鼠中，病变很小或没有。两位病理学家（S.B.S.和R.L.R.）以盲法将前列腺分类为无组织学异常（NHA）、低级别前列腺上皮内瘤变（LGPIN）、HGPIN、微创癌（MI）、IC或未分化癌（UC）[13,17]. 与正常区域相比，LGPIN和HGPIN的特征是上皮细胞在基底膜结合的原有腺体内分层和拥挤，并伴有细胞学异常，如细胞核增大(箭头,图2,A–C). HGPIN与LGPIN的区别在于这些特征的加重，包括显著的核异型性、更多的深染细胞核以及较高的有丝分裂和凋亡率(箭头,图2,B类和C类). MI被认为是单个细胞或细胞群突破含HGPIN腺体基底膜进入周围基质的病灶(箭头,图2D类). 当病变范围比上述MI更广时，将其指定为IC，腺体病灶显示浸润(箭头,图2E类). UC以侵袭性病变为特征，常表现为正常前列腺结构的破坏性过度生长，缺乏腺体分化，但具有神经内分泌分化的细胞学和组织学特征(箭头,图2F类). MT-DNIIR和NT小鼠主要表现为NHA或LGPIN，很少表现为HGPIN，但前列腺中没有癌症。鉴于癌症仅在表达T抗原的小鼠中被发现，且主要发生在背外侧叶，我们将重点放在这些小鼠的背外侧前列腺（DLP）上进行进一步的实验(表1).

前列腺病变中同时表达转基因和转化生长因子-β1

由于人类前列腺癌起源于腺上皮，因此证明上皮中存在这两种转基因非常重要。两者都有标签和挪威船级社根据免疫组化分析，转基因在12T-7f/MT-DNIIR和12T-10/MT-DNIIR小鼠的管腔上皮细胞中表达标签(箭头,图3一)和就地杂交分析挪威船级社(箭头,图3B类). 我们发现稳定水平的挪威船级社实时RT-PCR检测肿瘤进展过程中的表达(表2). 此外，根据免疫组织化学分析，TGF-β1在前列腺中被发现并定位于上皮(箭头,图3C类). 基于Meta-Morph分析，TGF-β1的染色强度相似。TGF-β的存在证明使用显性阴性TβRII阻断TGF-α信号传导是合理的。因此，在12T-7f/MT-DNIIR和12T-10/MT-DNIIR中出现的前列腺上皮病变中，可以看到转基因和TGF-β1的表达。

DNIIR转基因的表达降低了TGF-β下游靶点PAI-I的水平

PAI-I表达受TGF-β的正向调节[9,10]. 使用PAI-I作为TGF-β信号转导的标记物挪威船级社转基因可以破坏TGF-β信号传导。Western blot分析用于测定年龄匹配小鼠组织中PAI-I和β-actin的水平。使用Scion Image分析程序对PAI-I水平进行量化，并通过β-肌动蛋白水平对蛋白质负荷进行标准化。12T-7f/MTDNIIR小鼠PAI-I的平均归一化水平显著低于12T-7f小鼠PAI-1的平均归一化水平(P（P）< .05) (图4,一和B类). 同样，12T-10/MT-DNIIR小鼠PAI-I的平均正常化水平显著低于12T-10小鼠PAI-I的平均标准化水平(P（P）< .05) (图4,C类和D类). 因此挪威船级社转基因积极抑制前列腺中TGF-β信号传导。

与12T-7f小鼠相比，12T-7f/MT-DNIIR小鼠倾向于发展更多的IC，但不会发展更大的前列腺

12T-7f/MT-DNIIR前列腺肿瘤的组织学进展(n个=39）小鼠与12T-7f小鼠相似(n个=41）从12周龄到23周龄。这两个品系都主要发育有HGPIN，伴有前列腺腺增生和超细胞间质。为了确定肿瘤中TGF-β抑制的丧失是否刺激了生长，我们测量了湿前列腺重量，并通过计算体重百分比对动物大小的差异进行了标准化。比较12T-7f/MT-DNIIR和12T-7f小鼠前列腺重量占体重的百分比，发现肿瘤大小没有增加（数据未显示）。在12T-7f/MT-DNIIR小鼠中很少观察到侵袭性尿道周围和球部尿道肿瘤(n个=2）和12T-7f小鼠(n个= 1). 在12T-7f/MT-DNIIR小鼠前列腺的常规切片中，局部浸润性癌的病灶更常见(n个=6）比12T-7f小鼠(n个= 3) (表1). 无对照MT-DNIIR小鼠(n个=50）和NT小鼠（NT，n个=56）从12周龄到10个月龄发展为IC。

12T-7f/MT-DNIIR小鼠比12T-7f小鼠更容易发生广泛转移

12T-7f/MT-DNIIR和12T-7f小鼠均发生了主动脉旁淋巴结的显微神经内分泌转移(箭头,图5一)，肺部(箭头,图5B类)，肝脏(图5C类)，很少有骨头（12T-7f/MT-DNIIR，n个= 1; 第12T-7f页，n个= 1) (箭头,图5D类). 转移瘤经组织学鉴定，具有典型的神经内分泌分化特征。转移病灶免疫阳性标签(箭头,图5一)，转化生长因子-β1(箭头,图5B类)和神经内分泌标记物嗜铬粒蛋白A（CG），证实其转基因表达和神经内分泌分化(箭头,图5D类). 更多12T-7f/MT-DNIIR小鼠(n个=7）与年龄匹配的12T-7f小鼠相比发生了转移(n个= 4) (表1). 肺转移最常见，而肝转移发生在这些动物中的一部分，似乎表明转移更为广泛。12T-7f细胞系肝转移的比较(n个= 1) (箭头,图5E类)和12T-7f/MT-DNIIR线路(n个= 2) (箭头,图5F类)在12T-7f/MT-DNIIR小鼠中显示出更广泛的转移。在12T-7f小鼠模型中的这些结果表明，前列腺肿瘤中TGF-β途径的缺失会促进转移性疾病。

与12T-10小鼠相比，12T-10/MT-DNIIR小鼠倾向于发展更多的IC，但前列腺不会变大

表征挪威船级社在12T-10细胞系的肿瘤中过度表达对肿瘤进展的影响更为显著。12T-10/MT-DNIIR小鼠原发性前列腺肿瘤的组织学进展与12T-10小鼠相似。12T-10/MT-DNIIR小鼠(n个=22）和12T-10小鼠(n个=23）从6个月到10个月大，逐渐发展为HGPIN、前列腺局部浸润性神经内分泌癌和神经内分泌转移。比较12T-10/MT-DNIIR和12-T10小鼠的前列腺重量（占体重的百分比），发现肿瘤大小没有增加（数据未显示）。在12T-10/MT-DNIIR中很少观察到侵袭性尿道周围和球部尿道肿瘤(n个=3）和12T-10(n个=1）小鼠。在12T-10/MT-DNIIR小鼠中IC的发生率较高(n个=5）比12T-10小鼠(n个= 2) (表1).

12T-10/MT-DNIIR小鼠比12T-10小鼠发生更广泛的转移

12T-10/MT-DNIIR和12T-10小鼠发生LN、肺和肝转移的频率与12T-7f/MT-DNIIR和12T-7f小鼠相似，但更频繁。根据免疫组化和实时RT-PCR分析，转移灶表达标签、TGF-β1、CG和挪威船级社(表2). 根据组织学检查，12T-10/MT-DNIIR之间的累积转移发生率没有差异(n个=8）和12T-10(n个=7）只小鼠(表1). 然而，与12T-10小鼠相比，12T-10/MT-DNIIR小鼠的转移疾病程度显著增加。12T-10/MT-DNIIR小鼠肝和肺中明显的转移性结节(箭头,图6,一和B类)但在年龄匹配的12T-10小鼠的这些器官中未观察到明显的转移(图6,C类和D类). 比较12T-10/MT-DNIIR小鼠（●，n个=6/22）和12T-10（■，n个=1/23）小鼠表现出统计显著性(P（P）<.05）在12T-10/MT-DNIIR小鼠中的增加(图6E类). 此外，仅对有转移的小鼠进行比较，结果显示具有统计学意义(P（P）<.05）12T-10/MT-DNIIR小鼠总转移增加(n个=6/8）与12T-10小鼠相比(n个= 1/7). 在12T-10小鼠模型中的这些结果表明，转移性前列腺癌中TGF-β信号的丢失会增加转移病灶的数量。