LRRK2基因在帕金森综合征中的作用

摘要

帕金森氏病（PD）和许多常见的与年龄相关的疾病一样，被认为具有重要的遗传成分。多种证据表明，富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）是理解PD病因的关键因素。LRRK2型突变是遗传性和散发性PD的主要原因。在这篇综述中，我们讨论了LRRK2相关PD的多样性和变异性的病理和临床特征。此外，我们做了全面的文献综述，并为基因咨询提供了理论数据。此外，我们还提供了相关证据LRRK2型帕金森病的各种可能致病机制，如α-突触核蛋白、tau、炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍、突触功能障碍以及自噬溶酶体系统。基于上述工作，我们研究了GTPase内部和外部酶区域的活性，以获得潜在的治疗方法来解决LRRK2型问题。

介绍

帕金森病（Parkinson disease，PD），也称为摇晃性麻痹，是一种常见的神经退行性疾病，临床特征为静止不动、运动迟缓、肌肉僵硬以及姿势和速度异常，英国医生詹姆斯·帕金森（James Parkinson）首次系统地描述了这些症状。神经病理学特征是黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元的进行性丢失，存活神经元中存在α-突触核蛋白免疫反应性蛋白包涵体（称为路易小体）和营养不良的路易神经节。传统上，帕金森病被认为是一种散发性神经退行性疾病。然而，越来越多的家族聚集证据表明PD和基因之间可能存在联系。

迄今为止，除α-突触核蛋白(SNCA公司),停车场(停车场2),UCH-L1型(停车场5),粉红色1(停车场6),DJ-1型(停车场7),LRRK2型(停车场8)、和ATP13A2型(停车场9)根据家族连锁分析，还有GBA、VPS35、EIF4G1、PARK16已被隔离，负责PD。在所有致病基因中α-突触核蛋白和LRRK2型已被证明与常染色体显性遗传（AD）PD有关，而停车场，粉红色1，DJ-1型、和ATP13A2型与常染色体隐性遗传帕金森病有关。LRRK2突变是家族性和散发性帕金森病最常见的遗传原因[1]. 该基因的产物，也称为达达林，是一种高度保守的大型286-kDa蛋白，包含属于ROCO蛋白家族的多个独立结构域。迄今为止，该基因的20个突变中只有6个被证明是致病性的（图1)而LRRK2基因最常见的突变是G2019S（占家族性PD的5-6%，散发病例的1-2%），其重要性不仅在于其在特定人群中的相对高频率，而且还与晚发性散发性“经典”PD相关[2]。

图1

LRRK2和与PD ARM、犰狳相关的致病性突变的示意图；ANK，Ankyrin重复；LRR，富含亮氨酸重复序列；复合蛋白的ROC、Ras：GTPase；COR，ROC的C端子；WD40、WD-40域。潜在致病性突变同时显示。

基于之前的基础研究LRRK2型本文将介绍LRRK2参与帕金森病发病的可能机制。

LRRK2的结构和生理功能

LRRK2是一种异常大的蛋白质（2527个氨基酸），属于ROCO超家族成员，其特征是存在连接它们的复合物（Roc）G结构域、激酶结构域和Roc（COR）序列的羧基末端串联Ras。ROC–COR（ROCO）模块在整个进化过程中的高度保守性表明了这两个领域在功能上的密切依赖性[三]. 在Roco家族成员中，COR域总是与G域同时出现。COR结构域由两部分组成：与Roc结构域相互作用的高度保守的N末端部分和作为二聚体装置的较保守的C末端部分[4]. 此外，与蛋白质相互作用相关的结构域包括犰狳（ARM）、锚蛋白（ANK）、富含亮氨酸重复序列（LRR）和WD40结构域。在LRRK2的N末端区域，已鉴定出含有7个锚蛋白型重复序列和13个富含亮氨酸重复序列（LRR）的ANK结构域[5]而WD40域由C端重复序列组成[6]. （图1)此外，犰狳结构域是否是N末端的一部分一直存在争议，但最近的研究得出结论，答案是肯定的[三]。

LRRK2的生理功能可以从其两个不同的酶域中得到证明：激酶域可以催化磷酸化，ROC-GTPase域参与GTP-GDP水解。最近的一项研究表明，干扰激酶活性通过影响LRRK2水平而不是激酶活性本身来降低突变LRRK_2的毒性[7]. 除了这些酶功能外，多个蛋白-蛋白相互作用区域表明LRRK2可能作为支架蛋白发挥作用，有助于形成多蛋白信号复合物[8]. 虽然LRRK2的确切生理功能仍不清楚，但最近的研究表明，LRRK1至少参与细胞功能，如神经突起生长、细胞骨架维持、囊泡运输、自噬蛋白降解和免疫系统[9]. 此外，对大鼠神经元的实验表明，LRRK2在调节神经突起形态方面发挥了作用。

LRRK2中与PD相关的突变

为了研究由LRRK2型突变，人们对该基因的突变进行了广泛的研究。到目前为止，已确定的显性遗传PD相关突变LRRK2型包括第G2019S页、第R1441C/G/H页、第Y1699C页、第I2020T页和第N1437H页。

其中，G2019S在PD患者中尤为常见，分别占阿裔柏柏尔人和阿裔柏尔人的13%和13%。它也导致了1-7%的欧洲和美国起源的帕金森病家族病例和1-3%的散发性帕金森病[1]. 更具体地说，G2019S存在于5.6%的北美家族性PD家族中，6.6%的意大利、巴西和葡萄牙AD PD家族中以及1.7%的英国散发性PD患者中。此外，该突变占俄罗斯人群散发性PD病例的0.7%和AD病例的7.7%[10]. 有报道称，在KIN结构域中发现的p.G2019S，已被证明会产生一种过度活跃的激酶，会增加普通底物的自身磷酸化和磷酸化[11]. 对此有两种合理的解释；引入磷酸化位点（大多数突变引入S或T）或通过氢键稳定活性或非活性形式[5]。

然而，另一组没有发现任何显著变化。这种差异可能与Liu等人使用的底物的特定效应有关[12]. 除了p.G2019S突变外，还有两个错义变异体（R1628P和G2385R）与汉族和东亚人对PD的易感性有关。LRRK2变异体p.R1628P和p.G2385R不太可能引起PD，但分别增加约1.84倍和2倍的患病风险[13]。

LRRK2帕金森综合征动物模型

动物模型在研究LRRK2型.过度表达LRRK2型果蝇的DA反应性年龄依赖性降低运动活动和DA神经元的丢失[14–16]. 以类似的方式LRRK2型导致秀丽线虫DA神经元变性[17]. 与p.G2019S突变体或非转基因对照相比，人类WT LRRK2在秀丽线虫中的表达导致寿命更长[18]. 由于果蝇和秀丽隐杆线虫不表达a-突触核蛋白，并且LRRK2突变引起的帕金森病的一个显著特征是a-突触核蛋白病理学，因此研究苍蝇和蠕虫LRRK2神经退行性变机制的实用性可能存在问题。

与无脊椎动物模型相比，目前的转基因小鼠模型并不是非常稳健的PD模型。使用表达WT-LRRK2或带有p.R1441G或p.G2019S突变的LRRK2的细菌人工染色体（BAC）的转基因小鼠，很少有神经退化的证据[19]. 通过结合钙/钙调素依赖性蛋白激酶IIa（CamKII）启动子，有条件地表达WT或p.G2019S LRRK2也不能诱导多巴胺能神经元变性[20]. 此外，当p.R1441C突变在内源性调控元件的控制下表达时，通过敲除p.R1441突变，DA神经元没有退化[21]. 虽然未发现神经元明显死亡，但大多数当前的LRRK2转基因小鼠的黑质纹状体系统出现异常，包括多巴胺释放减少或行为缺陷，这些都是DA反应性的。与其他LRRK2转基因模型相比，具有渐进性年龄依赖性运动障碍的LRRK2p.R1441G BAC转基因小鼠具有左旋多巴和阿扑吗啡反应性，尽管尚未发现实质性神经变性[19]。

神经病理学LRRK2型-相关PD

有广泛的病理谱与LRRK2型突变，而同一突变可导致多种神经病理学（表1) [22–25]. 一些以过度磷酸化的tau或泛素免疫反应内含物为特征。然而，更多的病例表现出路易小体、路易神经炎和黑质神经元丢失的病理特征[26]. 不同突变之间的病理特征既可以表现为相互结合，也可以表现为分离。帕金森病神经退行性变患者尸检分析LRRK2型无论有无Lewy病理学，突变都已得到证实。因此，进一步研究比较LRRK2型这两种不良病理类型的突变病例有望有助于阐明不溶性α-突触核蛋白聚集体对这些PD遗传形式的神经变性的贡献LRRK2型和其他遗传形式的PD可能需要解释为什么某些基因突变与路易病理学相关，而其他基因突变没有，还有其他基因突变具有异质病理学特征[27]。

表1与帕金森综合征相关的LRRK2替代的特征

路易体（LB）是LRRK2型局限于脑干、皮层和边缘系统，或单纯的黑质变性的帕金森综合征可能完全不存在[2]. LRRK2在脑组织中的广泛表达以及LBs在脑干中的位置表明它们处于相同的途径。此外，除了在许多病例中检测到的τ蛋白异常外，还有进一步证据表明LRKK2突变可能上调许多关键通路，最终导致细胞死亡[2]. 据四名p.R1441C携带者的尸检报告，所有病例均发现黑质细胞丢失和胶质增生。其中2例为路易体病（LBD）或弥漫性LBD，其余无明显病理改变，最后一例为无LBD的缠结病理改变。关于p.R1441G替代物，有一份尸检报告显示黑质中存在孤立的神经元缺失，但没有LBD病理学[28]. 然而，没有p.R1441H替代携带者的病理报告。两个带有p.Y1699C替代携带者的家族中，一例表现为神经元缺失，黑质出现色素脱失和胶质增生，另一例则表现为泛素免疫反应性核内和细胞质内包涵体。p.I2020T突变的神经病理学表现为最初的单纯黑质变性。然而，最近的报告发现了一名LBD患者和一名胶质细胞质内含物（GCI）患者，这突出了LBD患者的多形性病理LRRK2型帕金森病[29]。

令人困惑的是，同一家族中的一个相同突变如何产生不同的病理。由于这种情况，有几个假设，它们并不相互排斥。例如，分别编码tau蛋白和α-突触核蛋白的MAPT和SNCA等其他基因座的遗传变异可能是影响病理学的明显候选基因。此外，不同的环境因素，如杀虫剂和头部创伤，可能会将LRRK2导向τ或α-突触核蛋白病理学。然而，这一环节仍需要大量与神经病理学相关的LRRK2 PD病例。此外，LRRK2功能获得（通过激酶失调和蛋白质聚集）和功能丧失（通过ERK途径失活或蛋白质转录下调）之间的相对平衡决定了不同的病理。

LRRK2相关帕金森综合征的临床特征

临床特征与临床和正电子发射断层扫描（PET）研究证实的晚发性散发性PD、运动迟缓、僵硬、震颤和良好的左旋多巴反应相似。然而，携带p.G2019S突变的女性患者的发病年龄比男性携带者早10年。虽然早期的研究认为震颤是LRRK2型在最近的一项研究中，LRRK2 p.G2019S患者的震颤发生率低于特发性PD患者[30]. 通过对一大组俄罗斯散发性和家族性帕金森病患者的LRRK2 p.G2019S突变结果进行分析，我们发现所有携带LRRK2p.G2019 S的患者都表现出典型的左旋多巴反应性帕金森综合征，具有不对称的症状发作以及运动迟缓、僵硬和静止性震颤的可变组合[31]. 此外，姿势性震颤是一个突出的早期特征。姿势不稳定和肌张力障碍（包括以单侧足肌张力障碍为表现的症状）很少见，并且没有认知异常和自主神经功能障碍。在一名同时携带LRRK2 p.G2019S和parkin外显子5重复的患者中，也存在左旋多巴诱导的运动障碍：这是一种明显的舞蹈病型运动障碍，涉及四肢（步态几乎不可能），伴有张力障碍性前斜颈[10]. 值得注意的是，在这个队列中，发病年龄存在差异，从39岁到71岁不等。为了解释这种变异性，对APOE基因患者进行的研究表明，所有患者都携带两个最常见的等位基因APOE-ϵ3。因此，APOE基因的基因型不能解释发病年龄的这种变异性[10]. 此外，阿根廷队列中LRRK2 p.G2019S突变的表型与特发性PD患者无明显区别[32]. 此外，多系统萎缩（MSA）在临床上以帕金森综合征为特征，然而，在LRRK2型基因不太可能与MSA相关[33]。

除了常见的p.G2019S携带者外，本研究还强调了LRRK2 p.R1441C患者的发病年龄分布和临床特征与特发性和LRRK2p.G2019 S帕金森综合征相似，表明LRRK1蛋白不同域突变的影响导致相似的表型[34]. LRRK2 p.R1441G转基因小鼠表现出运动能力下降，这被认为是人类PD运动症状的标志。与对照组相比，他们在早期也表现出胃肠功能障碍，但在精细行为、嗅觉、疼痛敏感性、情绪障碍以及学习和记忆方面没有异常[35]. 对于携带p.Y1699C突变的患者（主要来自英国血统），最初表现为不对称静止性震颤，然后是运动迟缓、僵硬和姿势不稳，对左旋多巴治疗反应良好[36]. p.Y1699C患者起病时的单侧腿部震颤和足部肌张力障碍是其突出特征。然而，PET扫描分析表明，与这两种突变相关的体内神经化学表型与散发性PD没有区别。

然而，迄今为止，大多数基因筛查仅限于PD临床人群，只有少数研究涉及其他神经退行性疾病。LRRK2型突变被认为不仅对PD的病因学起上游影响，而且对包括阿尔茨海默病（AD）在内的几种α-突触核蛋白和τ病理学也起上游影响[37]. 一项研究报告有两项LRRK2型表现出认知障碍的突变携带者导致临床诊断为皮质基底综合征（CBS）和原发性进行性失语（PPA），PPA是额颞叶痴呆（FTD）的一种亚型。这里的诊断是临床的，目前还没有病理证实。然而，影像学模式与CBS报道的萎缩模式一致，正常到低τ和正常淀粉样β42（Aβ42）的脑脊液（CSF）结果证实了非AD痴呆的诊断[38]. 另一项针对症状患者的研究LRRK2型患者、散发性帕金森病患者以及无症状患者LRRK2型突变携带者和匹配的健康对照者旨在评估LRRK2相关PD的可能内表型。与散发性帕金森病患者相比，LRRK2型患者出现运动症状较早，运动和非运动特征表现较良性。此外，LRRK2患者的抑郁得分较高。这些情绪障碍可能与发病年龄较低、对突变状态和将突变传递给后代的风险的认识有关。相反，情绪障碍易感基因可能会改变LRRK2型突变外显率。这两种关系都将对帕金森病的筛查和治疗产生深远影响[39]. 此外，在无症状患者的运动和非运动症状方面没有发现临床差异LRRK2型突变携带者与对照组相比。经颅超声显示两组患者的黑质均呈高回声，且无症状LRRK2型突变携带者[40]。

除了帕金森病的典型症状外，还有一些属于帕金森综合征的症状尚待检查，这些症状与LRRK2型.分析14LRRK2型晚发型（发病年龄）患者组成的队列中的突变 ≥ 56岁）散发性帕金森病和其他帕金森病疾病，如进行性核上性麻痹（PSP）、多系统萎缩（MSA）、皮质基底节退行性变（CBGD）和其他非典型帕金森综合征（AP），表明在这些帕金森病+综合征中变异罕见，提示：，尽管LRRK2阳性患者存在多形性病理，但对非帕金森病患者进行常规LRRK1筛查可能并不划算。更多关于LRRK2型帕金森综合征的突变，以及不同种族的散发性和家族性帕金森病患者中每个突变的确切年龄依赖性外显率[41]。

遗传咨询

遗传咨询被定义为一种沟通过程，处理与家庭中遗传疾病的发生或发生风险相关的人类问题。帕金森病的家族聚集性受到了广泛关注，已有家族描述表明帕金森病似乎遵循孟德尔遗传模式[42]. 中的突变LRRK2型与遗传性帕金森病密切相关，在诊断和咨询患者时应谨慎应用遗传性帕金森病患者的临床评估和详细病史。

来自全球21个中心的研究人员合作研究了遗传或有遗传LRRK2有害突变风险的个体患PD的风险，结果表明，散发性PD患者的LRRK2p.G2019S突变频率为1%，遗传性PD患者为4%。值得注意的是，中东地区发病率最高，南欧高于北欧。因此，应该对该人群中的患者进行仔细的临床评估和详细的病史。这种发病率与其他神经系统疾病的发病率相似，例如多系统萎缩（4/10万）、进行性核上性麻痹（6/10万），运动神经元病（6/100万），以及常见的单基因疾病，例如亨廷顿病（2/10万）和血友病A（5/10万）。此外，每10万例中有3例低估了LRRK2突变的总体流行率。此外，与特发性帕金森病患者相比LRRK2型G2019S的认知障碍和嗅觉减退风险较低。LRRK2 p.G2019S-相关PD与特发性PD相比是一种更良性的进展，因为特发性帕金森病患者比LRRK2p.G2019患者需要更早的多巴胺再灌注治疗。G2019S更容易出现药物诱导的运动障碍。遗传LRRK2 p.G2019S突变的人在59岁时患帕金森病的风险为28%，在69岁时为51%，在79岁时为74%[43]。

应根据患者的种族对其进行咨询。例如，LRRK2 p.G2019S突变在10%的散发性PD的德系犹太人和4%的散发性帕金森病葡萄牙患者中发现，但仅在1%的北美白人中发现。此外，患者应意识到，致病性突变的存在不会影响治疗选择，除非发现神经保护药物，否则检测的主要好处是提高诊断准确性。

LRRK2在帕金森病可能的发病机制中的作用（图2)

LRRK2和α-突触核蛋白

α-突触核蛋白是一种在大脑中高度表达的14kDa神经元蛋白。在正常神经元中，α-突触核蛋白通常与轴突末端的突触小泡有关[44]. 虽然α-突触核蛋白的生理作用基本上还不清楚，但研究表明，缺乏α-突触核蛋白的小鼠表现出缺陷的多巴胺能传递，而α-突突核蛋白的过度表达破坏了儿茶酚胺的释放，表明α-突入核蛋白可能在调节神经递质囊泡功能中发挥作用[45]。

图2

LRRK2介导微管蛋白相关τ的磷酸化，LRRK1与微管蛋白关联τ相互作用，导致形成三元复合物。LRRK2与β-微管蛋白之间的相互作用由LRRK2-Roc结构域和β-微管蛋白C末端介导。管状蛋白相关的tau被LRRK2磷酸化。LRRK2与GSK-3β直接相互作用，His–GSK-3α结合到LRRK3的激酶结构域（粗线）。LRRK2（细箭头）刺激GSK-3β对τ的磷酸化。P.G2019S-LRRK2对GSK-3β具有较高的结合亲和力，并表现出较强的刺激活性（粗线条和箭头）。

帕金森病患者尸检分析LRRK2型据报道，有LB和无LB的神经病理学都有突变。进一步的研究比较LRRK2型有和无路易病理学的突变病例对于阐明不溶性α-突触核蛋白聚集体在这些PD遗传形式的神经变性中的作用非常有价值。大约20–100%（平均值=60%）的SNCA阳性LBs含有LRRK2。纹状体α-突触核蛋白水平的增加诱导Lrrk2 mRNA水平的增加，这表明Lrrk2和α-突触核蛋白mRNA水平可能是共同调节的。全长LRRK2或含有其激酶结构域的片段都有显著的能力磷酸化丝氨酸129处的重组α-突触核蛋白。此外，Lrrk2的G2019S突变比野生型Lrrk2中磷酸化α-突触核蛋白的能力大得多[46]. 另一方面，LRRK2的缺失似乎会导致SNCA的积累和聚集。据报道，髓质中存在丰富的α-突触核蛋白病理学，该区域在疾病早期受累[47，48]表明α-synuclein磷酸化是疾病发病机制中的早期事件，可能有助于疾病传播[49]. 共免疫沉淀显示内源性LRRK2和α-突触核蛋白在细胞、小鼠和人脑组织中有相互作用。在HEK-293细胞的过度表达研究中也证实了这种相互作用。也证实了p.G2019S突变并没有改变LRRK2在该模型中与α-突触核蛋白相互作用的能力[50]。

LRRK2和tau

Tau是一种微管相关蛋白，通过促进微管聚合和抑制微管分离，参与稳定微管，并在中枢神经系统内轴突生长期间发挥稳定作用[51，52]. 与a-突触核蛋白形成淀粉样蛋白类似，τ可以聚集并沉积在神经原纤维缠结（NFT）中。证据表明，NFT不是有毒物种，因为携带NFT的神经元可以存活数十年，并且凋亡形态学和tau沉积之间没有明显的因果关系。然而，寡核苷酸tau是有毒的，因为在果蝇中仅通过tau表达就可以观察到视网膜退化[53，54]。

研究表明，LRRK2与微管蛋白相关的tau分子相互作用并磷酸化，但与游离tau分子无关[55]. 随后，他们发现Thr181是存在微管蛋白时LRRK2的磷酸化靶点之一。最近的一项研究证实了这一发现，该研究描述了LRRK2和β-微管蛋白之间的直接相互作用[56]. 为了确定LRRK2对tau磷酸化状态的影响，对LRRK2-过度表达SH-SY5Y细胞克隆进行了研究，发现在LRRK2-过度表达细胞中，Thr181和Ser396处tau的磷酸化显著升高，这种升高通过LRRK_2敲除而减少[57]. 抗LRRK2抗体共沉淀内源性LRRK_2和GSK-3β的现象表明，LRRK-2能够与人神经细胞中的GSK-3α相互作用。利用重组蛋白进行体外下拉实验的进一步研究证实，LRRK2与GSK-3β直接相互作用，并且His–GSK-3蛋白与LRRK3的激酶结构域结合。此外，体外研究进一步证实，LRRK2显著刺激GSK-3β对tau的磷酸化。研究人员还发现，与野生型相比-LRRK2型，第G2019S页-LRRK2型对GSK-3β介导的tau磷酸化表现出更强的刺激活性，对其他突变体如p.R1441C的刺激活性更强-LRRK2型和I2020T-LRRK2型等同于野生型（WT）-LRRK2[57]（图三).

图3

LRRK2与帕金森病α-突触核蛋白、tau、炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍、突触功能障碍和自噬溶酶体系统可能的致病机制均参与帕金森病的发病。打开箭头和填充箭头分别显示正（激活）和负（抑制）交互。

氧化应激诱导的有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活导致tau磷酸化，从而负调控其与微管的结合。研究表明，LRRK2抑制剂LRRK2-IN1可增强细胞内LRRK2-与微管蛋白的结合。在无细胞实验中，LRRK2与微管共注入增加了LRRK2GTPase活性；然而，微管的不稳定导致LRRK2激酶活性降低[58]。

神经退行性疾病，在中枢神经系统（CNS）、神经室和胶质细胞内具有显著的τ病理学，称为τ病。在tau病中，从微管分离的可溶性tau蛋白增加了可溶性tau的浓度，增强了其聚集的倾向。虽然一些τ蛋白病以帕金森综合征为特征，对左旋多巴有部分反应；一些具有FTD特征；其他则以运动神经元障碍表型为特征。例如，属于帕金森综合征的PSP是一种以τ病理为主、帕金森综合症突出的τ病。皮质基底变性（CBD）也是帕金森综合征的一部分。显微镜下有许多在其他tau病中未见的tau免疫活性星形细胞斑块[59]。

LRRK2与炎症反应

新的证据表明，炎症与神经退行性疾病的病理生理学和病因学密切相关，其触发因素可能是病原体、炎症通路的失调、蛋白质聚集和神经元的原发性炎症反应。目前的假设是，即使在PD发病之前，炎症也可能在疾病的前驱期发挥作用。使用米诺环素或应用非甾体抗炎药环氧合酶-2（COX-2），可溶性肿瘤坏死因子或IL-1β抑制剂可减弱PD-like疾病过程，这有力地支持了这一假设[60–63]. 虽然炎症和神经退行性变之间的确切关系仍不清楚，但在多巴胺（DA）神经退行症动物模型和PD患者尸检标本中对小胶质细胞、星形胶质细胞和淋巴细胞的描述将有助于解决这个问题。

LRRK2可能通过直接触发免疫细胞功能障碍而参与PD的发病机制。LRRK2的表达不仅限于神经细胞系，还可以扩展到抗原提呈细胞，包括小胶质细胞、单核细胞和B细胞，并参与对病原体的免疫反应[64，65]. 脂多糖（LPS）诱导炎症后，在小鼠黑质致密部（SNpc）或纹状体的小胶质细胞中观察到LRRK2蛋白的强烈诱导[66]. 然而，在LRRK2 p.R1441G敲除小鼠中，与野生型对照小胶质细胞相比，LPS激活的小胶质细胞显示促炎性细胞因子的表达升高，抗炎性细胞因子表达降低[67]. 此外，用LPS刺激的LRRK2 p.R1441G小胶质细胞的条件培养液测试初级皮层神经元，与野生型LRRK1小胶质细胞培养液相比，神经元死亡增加。总之，这些数据表明LRRK2参与炎症反应过程，LRRK2 p.R1441G突变可能会将小胶质细胞推向促炎状态，从而导致PD患者更严重的炎症和随后的神经退行性变。LRRK2 p.R1441G和iPD成纤维细胞在大多数检测中表现出相似的特征，而LRRK2p.G2019S表现出轻微的变化。在LPS应答的人类胚胎肾（HEK293T）细胞中，p.G2019S的过度表达增加了磷酸化p38和JNK的基础水平和LPS诱导的水平。这表明LRRK2是小鼠小胶质细胞炎症的积极调节因子LRRK2型突变可能会改变大脑的微环境，导致神经炎症[68]. G2019S激酶活性的增强对该突变体的神经毒性至关重要。然而，LRRK2的激酶活性是否与炎症反应的调节有关还存在疑问。

尽管确切的机制仍有待仔细探索，但相当大的进展支持LRRK2通过调节转录因子和诱导炎症基因作为炎症调节因子的作用。抑制或下调LRRK2可降低小鼠小胶质细胞内炎症介质的水平，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合酶[66，68]. 尤其是，LRRK2型敲除的小胶质细胞表现出核因子-κB转录活性的显著降低，这对于诱导促炎细胞因子至关重要。此外，机制研究表明，LRRK2是活化T细胞核因子（NFAT）转录因子的一种有效负调节因子，NFAT转录因子是一类参与免疫细胞的分子[69]. 这些数据可能表明LRRK2型突变可能与过度和缺陷的免疫反应有关，这会导致神经元功能障碍，增加神经元变性的脆弱性。

LRRK2与氧化应激

氧化应激可被称为细胞抗氧化防御机制无法将活性氧（ROS）水平保持在正常范围内的一种状态[70]. 原因可能是反应性自由基的过度生成或细胞缓冲机制的失效[71]. 尸检研究和体内观察的证据表明，氧化应激是PD发病机制中最常见的原因之一。

与氧化应激或无氧化应激相比，细胞过度表达LRRK2型WT和p.G2019S显示出截然不同的细胞死亡百分比。氧化应激下细胞中的百分比要高得多。这些数据表明LRRK2型WT或p.G2019S的表达与氧化应激协同增加细胞死亡，其中p.G2019的过度表达最为显著[72]. 解释协同神经毒性效应的一种可能性是潜在的旁观者效应。旁观者效应可以解释为在氧化应激下表达p.G2019S的细胞分泌的因子损害了其他邻近的未转染细胞。关于协同作用的确切机制，研究人员使用2′，7′-二氯荧光素二醋酸盐测定法测量了细胞内ROS，表明LRRK2可以增加细胞内的ROS水平，并且p.G2019S突变可能会增强这种效应，这种效应会因外部氧化应激而加剧。据报道，P.G2019S可增加LRRK2 WT蛋白的激酶活性，从而导致神经毒性增强。然而，数据表明，LRRK2的其他结构域也可以部分促进神经毒性，但激酶结构域是主要的管理者。幸运的是，DJ-1或ERK抑制剂治疗至少可以部分挽救这种神经毒性，这可能是我们选择的一种治疗方法[72]。

最近，在全长LRRK2研究的酵母模型中进行的进一步研究表明，LRRK1在氧化应激期间根据线粒体功能和内吞作用提供细胞保护[73]. 近年来，LRRK2与线粒体的联系得到了很好的证明，因此，人们进行了进一步的研究，以确定功能性线粒体是否决定LRRK_2对氧化应激的反应。答案是肯定的。但在缺乏激酶活性和WD40重复结构域的情况下，PD-突变体G2019S和p.R1441C没有观察到这种作用。对于PD-突变体，还观察到内吞缺陷对LRRK2-介导的过氧化氢保护产生负面影响。此外，另一项实验表明，过氧化物酶原3可保护突变LRRK2诱导的氧化应激相关大分子损伤[74]. 此外，LRRK2型突变体介导的过氧化物酶活性抑制可提高氧化剂水平和潜在的氧化应激[75]。

LRRK2与线粒体功能障碍

线粒体功能障碍与帕金森综合征间接相关。有明确证据表明PD患者黑质神经元内线粒体DNA（mtDNA）缺失的高负担[76]. 有更多令人信服的证据来自DA神经元线粒体转录因子A的条件性敲除小鼠，表现出mtDNA表达减少，进而导致帕金森综合征表型，其特征是成年人开始进行性运动功能损害，并伴有神经元内包涵体形成和DA神经细胞死亡[77]. 特发性帕金森病患者尸检生化研究支持线粒体参与帕金森病发病机制的进一步证据。

在原代培养的皮层神经元中进行的实验发现，内源性LRRK2的定位广泛分布于细胞质中，部分与细胞C（线粒体标记物）共定位。LRRK2 WT和LRRK2p.G2019S在转染后均可诱导线粒体断裂，而后者的作用更为严重，这与早期的说法一致，与细胞死亡有关[78，79]. 这一结果表明，LRRK2可能是线粒体裂变/融合动力学的重要调节器。此外，内源性LRRK2被进一步证实与线粒体分裂动力蛋白样蛋白1（DLP1）在皮层神经元中部分共定位，这表明DLP1很可能参与LRRK2-诱导的线粒体分裂[80]. 也有报道称，在p.G2019S突变的PD患者中，线粒体膜电位和细胞内总ATP水平降低，同时线粒体伸长和互连性增加[81]. 同样，在秀丽线虫中也可以观察到lrk-1（LRRK2的内源性同源基因）敲低导致细胞存活率降低并伴有线粒体功能障碍[82]. 还有人类LRRK2型在线虫中表达的线虫在线粒体复合物抑制剂如鱼藤酮或百草枯的治疗下提高了其存活率[83]. 所有数据证明LRRK2可能在调节线粒体内环境平衡中发挥重要作用[84]. 此外，LRRK2突变可能会破坏线粒体功能，并增加氧化应激患者诱导多能干细胞（iPSC）衍生神经细胞的脆弱性。与未携带LRRK2 p.G2019S突变的健康受试者的细胞相比，携带LRRK1 p.R1441C突变的患者或高危个体的iPSC-derived神经细胞中的线粒体DNA损伤水平更高LRRK2型突变，因为mtDNA损伤会损害线粒体功能。然而，经锌指核酸酶修复LRRK2 p.G2019S突变后，分化的神经原细胞和神经细胞中未检测到线粒体DNA损伤。这些证据都表明LRRK2型突变和线粒体DNA损伤可用于检测致病机制和筛选治疗策略[85，86]。

LRRK2与突触功能障碍

越来越多的证据表明，突触功能障碍可能是神经退行性变的早期事件，并与PD密切相关LRRK2型初级皮质培养物中含有PD-相关突变的LRRK2 cDNA可导致逐渐的轴突损伤和收缩，伴随着轴突自噬的诱导，并可导致轴突缩短[87，88]. 这表明突变体LRRK2下游神经退行性级联反应的早期事件可能以神经炎/突触室为靶点。

内源性和过度表达的LRRK2免疫反应已定位于神经元的各种膜结构，包括高尔基体和内质网、溶酶体、线粒体、质膜，以及部分定位于突触小泡、内吞途径的结构，包括脂筏、小窝颈、，含网格蛋白的内体、多泡内体和微管[89–91]. 通过测量两对突触连接的锥体皮质神经元的诱发兴奋性突触后电流（EPSC）来测试LRRK2型沉默可以影响突触前机制，发现突触后神经元的EPSC振幅比对照组增加了两倍以上。此外，在突触前触发之后，siLRRK2对显示出在基线上产生EPSC的较高概率。此外，另一数据来源表明，LRRK2可以调节突触前束内的小泡运动，控制突触前束内突触小泡的分布，而不影响易释放池（RRP）的大小[92]. 一项旨在确定LRRK2是否参与果蝇突触囊泡内吞的经验表明LRRK2型突变体在强烈刺激时不能保持释放，突触囊泡内吞减少的突变体中经常观察到缺陷。然而LRRK2型突变体既不是由刺激期间囊泡融合减少引起的，也不是由神经肌肉接头（NMJ）处的主要形态学变化引起的。内啡肽a（EndophilinA，EndoA）是一种进化保守蛋白，在膜制表、囊泡形成和促进囊泡脱膜中发挥重要作用，以调节体内突触囊泡的内吞作用。因此，EndoA功能障碍会导致突触囊泡内吞的严重缺陷[93]. 此外，证据表明，EndoA是体外LRRK2激酶活性的靶点，而一个保守位点丝氨酸75（S75）是LRRK2-依赖性磷酸化的靶点[92]. 也有动物实验表明，EndoA S75磷酸突变体的表达具有与内吞缺陷平行的突触囊泡再循环缺陷。进一步研究表明，LRRK依赖性EndoA磷酸化的增加和减少都会阻碍突触囊泡内吞。此外，另一项最近的研究表明，自噬可能在帕金森病突触结构/功能的形成中起到代偿或有害作用[94]。

LRRK2与自噬溶酶体系统

溶酶体是一种动态酸性细胞器，可通过多种降解途径降解细胞内成分，包括内吞、吞噬和水解酶的自噬[95，96]. 来自特发性帕金森病患者和帕金森病毒性和遗传啮齿动物模型的死后大脑样本显示，神经元内溶酶体数量减少，溶酶体相关蛋白水平降低，未降解的自噬体积聚[97，98]. 此外，有报道称，在培养的多巴胺能神经元中，发现溶酶体介导的自噬体清除受损，这些神经元是从散发性和遗传性帕金森病患者的皮肤成纤维细胞获得的重组iPSCs生成的[99]. 机制研究表明，PD-连锁溶酶体缺陷导致几乎所有多巴胺能神经退行性变细胞死亡前自噬受损[100]. 此外，通过敲除小鼠儿茶酚胺能神经元内自噬所必需的自噬相关7基因，结果显示纹状体多巴胺降低；突触前神经递质异常；与年龄相关的轴突形态学改变、运动障碍和神经变性[101–103]. 如上所述，新的证据表明溶酶体功能受损可能与PD的发病机制有关。

实验发现，LRRK2特异性地定位于膜微结构域，如小窝颈部、微绒毛/丝状体和对应于多泡体（MVB）和自噬空泡（AVs）的细胞质点。尽管LRRK2型突变和溶酶体途径尚不完全清楚，最近在细胞和敲除小鼠中进行的研究表明LRRK2负责调节细胞骨架的组装[104]以及溶酶体-自噬途径。LRRK2 p.R1441C突变导致自噬应激，其特征是MVB积聚、异常AV和骨骼样细胞损伤。LRRK2中P.R1441C突变显示大脑皮层自噬空泡密度增加。最后，siRNA-介导LRRK2型当自噬被抑制时，敲除显示出逆转饥饿诱导的细胞死亡负面影响的趋势[90，105]. 对于LRRK2 p.G2019S，神经元培养物中存在由溶酶体肿胀形成的轴突球形内含物[87]. 它还可能导致分化的神经母细胞瘤细胞的轴突缩短，包括主动自噬。此外，p.G2019S突变的成纤维细胞表现出较高的自噬活性水平，这可能通过增加凋亡标志触发细胞死亡。确切的证据表明，p.G2019S突变通过MAPK/ERK激酶磷酸化诱导自噬，而MEK1/2的高选择性抑制剂对这种自噬的抑制加剧了p.G2019突变细胞的敏感性[106，107]. 在人脑中，WT LRRK2位于神经退行性疾病中形态学改变的神经元内的溶酶体腔室中，在LB病理病例中增加[108]. 与果蝇一样，LRRK2位于晚期内体和溶酶体的膜中，负调控溶酶体的rab7依赖性核周定位，并通常与晚期内体转运的关键介质rab7相互作用。然而LRRK2型促进rab7依赖的核周溶酶体聚集，将内溶酶体功能障碍与LRRK2介导的PD发病机制联系起来[109]. 因此，LRKK2的功能似乎是溶酶体蛋白运输，并可能通过调节细胞骨架的重排来实现。此外，来自LRRK2-/-肾脏的年龄依赖性分析的证据表明LRRK2型突变可能通过破坏蛋白质降解途径导致PD和细胞死亡，这表明LRRK2是自噬溶酶体途径正常调节所必需的[110]. 然而，缺乏证据表明LRRK2在大脑中具有这种调节作用。在mTORC1的翻译靶点没有任何改变的情况下，使用LRRK2药物抑制剂可以刺激大自噬，这表明LRRK2中调节自噬囊泡的形成独立于典型的mTORCl信号[111]. 其他数据表明，溶酶体NAADP受体（如TPC2）可能是LRRK2的靶点，随后从溶酶体释放钙，导致激活CaMKK/AMPK通路以诱导自噬[112]. 此外，最近还发现，来自G2019S突变LRRK2诱导的多能干细胞的人类多巴胺能神经元的自噬流量减少，这与p62蛋白、自噬体和脂滴的增加相一致，与自噬清除受损相一致，而非对照患者，经过长期培养[99]. 目前，尚不清楚LRRK2型突变能够诱导自噬流量的增加或减少；因此，目前尚不清楚LRRK2在自噬控制中的作用是正的还是负的。总之，自噬调控最终可能成为预防和治疗PD的有用和有效方法，而LRRK2的研究可能是一种有价值的方法。

LRRK2作为帕金森综合征的治疗靶点

对于帕金森病的治疗，应采取综合治疗，如药物治疗、手术治疗、康复治疗、心理治疗等。其中，药物治疗是首选和主要治疗方法。例如，丘脑底核（STN）的深部脑刺激（DBS）是一种公认的治疗晚期PD的方法，STN-DBS的结果不受LRRK2 p.G2019S突变的影响[113]. 然而，所有的治疗都无法阻止PD的进程，更不用说治愈了。所有疗法的主要目标都是缓解帕金森病的运动和非运动症状。因此，需要新药来逆转、预防或减缓帕金森病的进展是帕金森病研究的主要目标之一。

由于LRRK2是一种激酶，有一种假说认为靶向激酶活性可能是家族性帕金森病的一种治疗方法。此外，由于LRRK2相关的帕金森病和散发性帕金森病具有相同的临床特征，可以推断靶向激酶活性也可能对特发性疾病有效（表2).

表2LRRK2作为帕金森综合征的治疗靶点

蛋白激酶是帕金森综合征的治疗靶点，因为它们在包括神经退行性疾病在内的各种疾病中发挥着重要作用。一些小分子激酶抑制剂，如伊马替尼（Gleevec）、索拉非尼（Nexavar）、舒尼替尼（sunitinib）和雷帕霉素（Sirolimus）已被美国食品和药物管理局认可并上市。由于直接监测细胞中LRRK2的活性将有利于LRRK1抑制剂的开发，最近的研究表明，在ATP-竞争性LRRK2抑制剂存在的情况下，针对活化片段的单克隆抗LRRK_2抗体与天然LRRK-2蛋白的结合效率较低，并诱导了一种假设，即抗体在天然条件下优先与LRRK2-的活性构象结合[114]. 激酶经常参与信号级联，LRRK2的上游和下游效应器也是PD药物治疗的诱人靶点。可被药物干预的替代激酶相关信号通路包括蛋白激酶Cd、MLK–c-Jun N末端激酶信号级联、，和AKT/蛋白激酶B信号级联，均参与细胞凋亡[115，116]. 大多数激酶抑制剂的选择性是不完全的，因为它们中的大多数会根据激酶这一区域的结构相似性抑制其他激酶。然而，最近有报道称，LRRK2-IN1和CZC-25146比其他激酶对LRRK2具有更好的选择性[117，118]. 在具有阿霉素诱导的神经炎表型的LRRK2 p.G2019S细胞中进行的实验，在添加特异性和强效激酶抑制剂in-1后显示出逆转的表型。此外，慢病毒介导的LRRK2 p.G2019S等位基因特异性小发夹RNA转移可逆转LRRK2p.G2019-S介导的轴突延伸钝化[119]. 在表达人p.R1441C-和p.G2019S-LRRK2的转基因秀丽隐杆线虫中进行的另一项类似研究表明，TTT-3002和LRRK2-IN1挽救了多巴胺能损伤的行为缺陷特征。然而，TTT-3002和LRRK2-IN1对p.A2016T突变无效LRRK2型，表明他们瞄准了LRRK2型具体来说[120]. 体外和体内的一些证据表明，CEP1347具有很高的治疗潜力，因为它在多种PD和神经退行性疾病模型中显示出神经保护作用。然而，就临床而言，疗效并不理想[121]. 这个例子提醒我们注意不同的工作台和床边的差异，以及评估激酶抑制剂作为PD神经保护剂的潜在陷阱[122]。

除了LRRK2激酶抑制外，还有其他可能的靶点，如调节LRRK2GTPase活性。Fameshift LRRK2可以通过与GTP的结合与其他不同的蛋白质相互作用。这种治疗可能对p.R1441C-和p.Y1699C-突变株特别有效LRRK2型因为LRRK2 p.R1441C和p.Y1699C突变的数据具有较低的GTPase活性，这表明GTP结合形式与疾病有关。因此，阻断ROC的GTP结合囊或刺激GTPase活性以限制致病性相互作用可能是LRRK2-associated PD的理想治疗靶点[123]。

此外，Dranka等人进行的一项研究表明，二环辛素（5,5'-脱氢二乙酰丙酮）是一种由罗布麻素（4-羟基-3-甲氧基苯乙酮）转化而成的合成化合物，可以预防LRRK2 p.R1441G转基因小鼠的早期PD症状。用尿苷治疗后，LRRK2 p.R1441G小鼠的极点试验和Rotor-Rod性能的改善表明，尿苷是一种可行的神经行为功能保护剂[124]. 最后，研究表明，删除p.G2019S或p.R1441C的N末端LRR部分或WD40可以挽救LRRK2诱导的神经元细胞毒性，因为这些没有催化活性的蛋白-蛋白质相互作用域可能在介导LRRK1激酶活性诱导的细胞毒性中发挥作用[125]. 抑制肽阻断参与介导LRRK2诱导的细胞毒性的蛋白质的结合，也可能是治疗干预的一个要点，与其他相互作用的球状蛋白质一样。

结束语

PD是一种破坏性的神经退行性疾病，但对疾病病因的准确理解和预防治疗方法仍不明确。基因突变的鉴定LRRK2型导致常染色体显性帕金森综合征与特发性疾病极为相似，这标志着帕金森病研究的新篇章。LRRK2，也被称为dardarin，是一种功能未知的大蛋白，因为到目前为止还没有发现生理底物。因此，未来的研究应该探索更好地理解达达林的功能，并确定可能对疾病特征产生影响的相互作用物的识别，这对于阐明PD的生化途径是绝对必要的，全序列分析是最优选的突变筛查方法，而将重点放在编码达达林最后五个结构域的外显子上可能是一种更有效的筛查方法。病理变化表明不同形式的神经退行性变之间存在联系。然而，LRRK2功能障碍如何导致PD尚不清楚。我们从几个方面综述了LRRK2与PD的可能致病机制。

尽管在过去几年里，人们对LRRK2了解了很多，但许多问题仍然没有得到解决。例如，LRRK2 PD相关突变对神经元有什么确切的功能影响？LRRK2型有人认为，这种表达会导致神经元活性的丧失，并且对这些细胞上的突起长度也有很大影响，这是否是真正的毒性尚不清楚。为什么多巴胺能神经元对LRRK2型当蛋白质具有广泛的表达模式时发生突变？此外，LRRK2是否对多巴胺能神经传递至关重要尚待观察。