背景

甲状腺癌（THCA）的发病率在过去几十年里在全球范围内稳步上升，预计该病将成为第四大癌症类型[1]. 乳头状甲状腺癌（PTC）是最常见的亚型，约占全部THCA的85%。尽管PTC患者在手术治疗后可能会经历长期和疾病特异性生存，但预后不良经常发生，这与肿瘤区域复发或转移密切相关[2]. 因此，更好地理解PTC的分子机制和识别新的靶点仍然是迫切需要的。

E3泛素连接酶是一类能够催化泛素向底物转移的关键酶，其基因改变、异常表达或功能障碍是人类癌症发生和发展的原因[三]. 因此，它们正在成为癌症治疗的有吸引力的治疗靶点[4]. Pellino-1（PELI1）是一种新型的肿瘤相关E3泛素连接酶，已被发现在多种癌症中上调并与不良临床预后相关，如大B细胞淋巴瘤[5,6]，肺癌[7,8]和乳腺癌[9]. 此外，PELI1可以调节mTORC1的代谢作用，抑制黑色素瘤中的抗肿瘤T细胞反应[10]. 这些报告确定PELI1是一种致癌基因。然而，最近的一项研究报告称，PELI1可以通过抑制食管鳞癌中的非经典NF-κB来提高放疗敏感性[11]表明PELI1是一种肿瘤抑制因子。然而，PELI1在PTC中的表达模式和功能重要性尚不清楚。

MicroRNAs（miRNAs）是一种小的非编码RNA，通过与mRNA的3′-非翻译区（3′-UTR）相互作用调节同源靶基因的表达，导致mRNA降解或翻译抑制[12]. 显然，miRNAs是基因的微调器[13,14]. 大量研究表明，miRNAs可以作为新型癌症个体发生或肿瘤致癌抑制因子[15]. 特别是，miRNAs与PTC的发展和进展密切相关[16]. 因此，作为PTC转录后调控机制，Peli1的表达是否受到某些miRNAs的调控值得探讨。

在这里，我们发现PELI1在PTC样品和细胞中广泛不受调控。PELI1促进PTC细胞增殖和迁移，这与PI3K-AKT信号通路的激活有关。值得注意的是，PELI1被miR-30c-5p反向调节，是miR-30c-5p在PTC中的直接功能靶点。此外，miR-30c-5p可被人脐带间充质干细胞（hUCMSC）掺入并释放在细胞外囊泡（EVs）中，在体内外可抑制PELI1的表达和PTC的生长。我们的研究结果不仅表明miR-30c-5p/PELI1/PI3K-AKT轴可能是调节PTC进展的关键途径，而且还显示了一种基于miR-30c-5p-携带hUCMSC-EV的PELI1抑制和PTC治疗的新的翻译治疗方法。

材料和方法

人体样本

PTC组织和人脐带样本分别取自江苏大学附属医院（中国镇江）知情和同意的PTC患者和母亲。本研究得到了江苏大学附属医院伦理委员会的批准。

细胞培养

W3、TPC-1和Nthy-ori 3–1购自中国科学院细胞库，在含有10%FBS（Gibco）和1%pen/strep（Gibco）的DMEM培养基中培养，37°C，5%CO2如前所述，从新鲜脐带样本中分离出HUCMSCs[17,18]并保存在干细胞培养基中（Cyagen，广州，中国）。

慢病毒转导与寡核苷酸转染

PELI1过表达慢病毒颗粒（LV-PELI1）、抑制结构物（sh-PELIl）及其相对对照物（分别为LV-NC和sh-NC）包装并从GeneChem（中国上海）购买。根据制造商手册，PTC细胞感染重组慢病毒转导单位加上5μg/ml聚brene（Sigma，Natick，MA）。泥质1shRNA序列：5′-GCCAAATGGAAGACATCAGAT-3′；加扰shRNA:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

合成miR-30c-5p模拟物、模拟对照、miR-30c-5p抑制剂和抑制剂对照购自GenePharma（中国上海）。pcDNA-Peli1质粒和空载体由中国科学院肖一川教授（中国上海）赠送。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）将50 nM miR-30c-5p模拟物或100 nM miR-30c-5p抑制剂或miR-30c-5p模拟体加上1μg Peli1质粒转染PTC细胞。

miR-30c-5p（miR-30c-5p-EV）设计的HUCMSC-EV

用50 nM miR-30c-5p模拟物或使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）的模拟NC转染HUCMSCs，然后用条件培养基培养[19]. 如前所述，通过超高速离心（佛罗里达州迈阿密Beckman Coulter Optima L-100 XP超离心机）从条件培养基中分离出MiR-30c-5p-EV或NC-EV[17,18].

使用透射电子显微镜观察miR-30c-5p-EV的形态（JEM-1200EX；日本东京JEOL有限公司）。根据制造商手册，使用ZetaView PMX 110（particle Metrix，Meerbusch，Germany）测定电动汽车的颗粒数量和尺寸分布。

细胞治疗

将PELI1过度表达的PTC细胞（LV-PELI1）及其对照细胞（LV-NC）接种在6孔板中。隔夜培养后，用溶于DMSO或仅用DMSO的LY294002（20μM；MedChem Express，Monmouth Junction，NJ）处理LV-PELI1细胞。培养12小时后，收集细胞进行蛋白质提取。

将PTC细胞接种在6孔板（10%无EVs的FBS完全DMEM培养基）中，并用PBS、hUCMSC-EV（104颗粒/电池），NC-EV（104颗粒/细胞）或miR-30c-5p-EVs（104颗粒/细胞），如前所述，每天三天[20].

细胞增殖试验

根据制造商的方案，使用CCK-8测定法（KeyGEN BioTECH，中国南京）测定细胞活力。简言之，将PTC细胞接种在96孔板中（2×10三/well）。在指定的培养小时（24、48、72和96）后，向每个孔中添加CCK-8溶液（10μL），然后再培养2小时。使用微孔板阅读器（Synergy HT、BioTek、BioTek Winooski、VT）在450 nm处测量吸光度。

对于集落形成分析，将转染慢病毒、寡核苷酸或EVs处理的W3和TPC-1细胞接种在6孔板（1000/孔）中，并在含有10%FBS的培养基中培养。10天后，用甲醇固定细胞，并用0.4%结晶紫溶液染色，最后拍照。对含有50个以上细胞的菌落进行计数。

细胞迁移分析

PTC细胞被镀入上Transwell室（W3:5×104; TPC-1:3×104在200μl无血清培养基中）。用600μl培养基填充下室，补充10%FBS。培养12小时后，去除上膜表面的细胞，用甲醇固定膜，用0.4%结晶紫溶液染色，用尼康显微镜成像。

对于伤口愈合测定，用200μl移液管尖端刮伤单层细胞。使用PBS清洗分离的细胞，并在显微镜下记录划痕后48小时相同区域的图像。

小鼠模型研究

从扬州大学比较医学中心（中国扬州）购买4周龄雌性BALB/c裸鼠。

为了评估PELI1对PTC生长的影响，W3细胞稳定转染sh-PELI1或对照sh-NC（2×106细胞）分别皮下注射到小鼠右侧或左侧侧翼。

为了研究miR-30c-5p-EVs对PTC生长的影响，将裸鼠右侧皮下接种W3细胞（2×106单元格）。肿瘤生长7天后，PBS（20μL）、hUCMSC-EV、NC-EV或miR-30c-5p-EVs（各种EVs：2×1010按照Bruno等人的描述，每周通过瘤内注射给药20μL PBS）[19]. 第28天，切除肿瘤进行检查。肿瘤体积（mm）三根据肿瘤的长度（L）和宽度（w）轴使用以下公式计算：V=L×w2/2。

RNA分离和实时定量PCR

根据制造商的方案，使用Trizol试剂（Invitrogen）或mirVana RNA分离试剂盒（Ambion，Austin，TX）分离总RNA。使用All-in-one™qPCR Mix（Genecopoeia）在QuantStudio 5实时系统中进行实时PCR（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。所有用于实时PCR的引物，包括PELI1（HQP0504204）、β-肌动蛋白（HQP016381）、Has-miR-30c-5p（HmiRQP0396）和U48（HmiRQP9021），均购自Genecopoeia（中国广州）。的相对表达式PELI1公司miR-30c-5p分别归一化为β-actin和U48，并通过2-ΔΔCt方法，基于前面的描述[21,22].

免疫组织化学（IHC）分析

按照之前的研究所述，对组织进行了IHC分析[17,23]. 简单地说，PTC组织切片与PELI1抗体（12053–1-AP，稀释1:200；Proteintech，Rosemont，IL）孵育；将小鼠肿瘤切片与Ki-67抗体（ab16667，稀释1:200；Abcam，Cambridge，MA）或MMP2抗体（10373–2-ap，稀释1:2200；Proteintech）在4℃孵育过夜，然后用HPR-结合二级抗体孵育。以二氨基联苯胺为底物。用苏木精对细胞核进行复染。所有照片都是用尼康显微镜拍摄的。使用Image-Pro Plus软件（X版；加利福尼亚州圣何塞Adobe）测量小鼠肿瘤切片中Ki-67和MMP2的积分光密度。

蛋白质印迹

使用RIPA缓冲液（Cell Signaling Technology Inc.，Danvers，MA）提取蛋白质，并使用BCA蛋白试剂盒（Beyotime）进行定量。如前所述进行Western blot分析[21]. 抗PELI1抗体（sc-271065）购自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）；从Abcam购买磷蛋白-AKT（ab81283）、AKT（ab179463）、Ki-67（ab16667）、TSG101（ab133586）、HSP70（ab181606）和HRP-linked抗兔/鼠IgG（ab97051/ab6728）；MMP2（10373–2-ap）和GAPDH（60004–1-lg）购自Proteintech。使用Image J（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）对蛋白质条带的强度进行量化，并将数据与相应GAPDH条带的数据进行标准化。

萤光素酶报告基因测定

用500 ng pmiR-RB-report-h联合转染PTC细胞-PELI1公司-使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）的3′UTR（野生型和突变型；GeneCopoeia）和50 nM miR-30c-5p miRNA（模拟和模拟NC；GenePharma）。48小时后，收集细胞，并使用Luc-Pair™Duo-luciferase HS检测试剂盒（GeneCopoeia）测量其荧光素酶活性。结果表示为相对萤火虫荧光素酶活性，这是在归一化Renilla荧光素酶活性后获得的。

统计分析

使用GraphPad Prism（5.0版；加州La Jolla）进行统计分析。数据表示为平均值±标准偏差。使用Student t检验或单向方差分析（Tukey-Kramer事后检验）对各组进行比较。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

PELI1在人类PTC样本和细胞中上调

首先，使用Starbase分析PTC中PELI1的mRNA表达(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php). 我们发现PELI1公司与正常组织相比，THCA标本中的表达显著增加（图1A） ●●●●。皮尔逊相关检验表明PELI1公司与基-67（一种常用的增殖标记物）（图1B） ●●●●。此外，对UALCAN数据的分析(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)表明了这一点PELI1公司在淋巴结转移患者的THCA组织中表达较高水平（图1C） ●●●●。

图1
图1

PELI1在PTC组织和细胞系中高度表达。A类StarBase v3.0数据集(http://starbase.sysu.edu.cn/)表明了这一点PELI1公司与正常组织相比，THCA组织中的表达显著上调。B类相关分析PELI1公司和Ki-67基因在THCA中使用starBase v3.0。C类MRNA表达水平PELI1公司使用UALCAN数据集，在正常组织、无区域淋巴结转移的甲状腺癌组织（N0）和在1至3个腋窝淋巴结中有转移的甲状腺肿瘤组织（N1）中(http://ualcan.path.uab.edu/index.html).D类相对PELI1公司通过实时PCR检测邻近正常组织和PTC肿瘤组织中的表达水平（n=37）。E类,F类实时PCR分析显示PELI1公司PTC肿瘤直径≥2 cm与肿瘤直径<2 cm的表达(E类)与非转移性PTC相比(F类).G公司人类PTC组织和邻近非肿瘤组织中PELI1的IHC染色代表性图像（n=10）。比例尺代表100µm（上面板）和50µ米（下面板）。H（H）使用人类PTC组织（T）和邻近非肿瘤组织（N）进行蛋白质印迹分析。带强度根据相应的GAPDH进行了标准化，其数量分别表示为N组的倍数增加。我使用western blotting分析Nthy-ori 3–1、TPC-1和W3的PELI1表达，两个独立实验显示了代表性结果*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01

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然后PELI1公司实时荧光定量PCR检测PTC及相应的邻近组织。PELI1公司PTC样本中的表达明显不受调控，而邻近组织中的表达则不受调控（图1D） ●●●●。此外，肿瘤较大（≥2cm）的患者表现出较高的PELI1公司与小肿瘤患者（<2cm，图1E） 。此外，泥质1与原发性PTC组织相比，转移性PTC组织中的表达增加（图1F） ●●●●。与mRNA水平一致，PTC组织中PELI1蛋白水平高于相邻的非肿瘤组织，根据IHC，PELI1主要定位于PTC细胞的细胞核和细胞质（图1G） ●●●●。还使用Western blot研究了PTC组织中PELI1的蛋白表达，发现PTC组织的PELI1表达高于匹配的相邻正常组织（图1H） ●●●●。此外，PTC细胞系（W3和TPC-1）中PELI1的蛋白表达水平高于正常人甲状腺细胞系Nthy-ori-3–1（图1一） ●●●●。总之，这些发现表明PELI1在PTC中上调，并可能在PTC的进展中发挥致癌作用。

PELI1促进PTC细胞体外增殖和迁移，PELI1的敲除抑制体内PTC肿瘤生长

为了评估PELI1在PTC肿瘤发生中的功能意义，我们分别通过慢病毒颗粒转染PELI1过表达（LV-PELI1）或抑制（sh-PELIl），在TPC-1和W3细胞中过度表达或敲除PELI1蛋白（图2A） ●●●●。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析结果显示，PELI1过度表达显著增加PTC细胞增殖（图2B） 而PELI1的敲除显著降低了细胞增殖（图2C） ●●●●。在克隆形成试验中观察到类似的效果，其中PTC细胞的菌落数在PELI1过度表达时显著增加，在PELI 1敲除时减少（图2D和E）。为了验证PELI1对PTC细胞迁移的作用，我们进行了Transwell迁移分析，其中PELI1的过度表达增强了细胞迁移，而PELI1缺失抑制了迁移PTC细胞的数量（图2F和G）。类似地，划痕试验的结果显示，PELI1过表达增加了TPC-1和W3细胞的迁移（图2H） ●●●●。然而，沉默PELI1降低了TPC-1和W3细胞的迁移能力（图2一） ●●●●。

图2
图2

PELI1过度表达可增强PTC细胞的增殖、迁移和致癌转化。A类Western blotting显示慢病毒感染的W3和PTC-1细胞中的PELI1水平。结果代表了三个独立的实验。B类,C类进行CCK8分析以评估PELI1过度表达的W3和TPC-1细胞的细胞增殖(B类)或击倒(C类)24、48、72和96小时（n=5）。D类,E类对PELI1过度表达或PELI1缺失的W3和TPC-1细胞进行克隆形成试验，显示结晶紫染色细胞集落的代表性显微照片(D类)，并显示了菌落形成分析的量化（n=3）(E类).F类,G公司采用Transwell分析法估计PELI1过度表达或敲除的W3和TPC-1细胞的细胞迁移，显示Transwell检测的代表性图像（×200）(F类)，并显示了Transwell分析的定量（n=3）(G公司).H（H）,我稳定表达PELI1或敲除（n=3）的W3和TPC-1细胞划痕伤口愈合分析的代表性图像（×100）。J型–L（左）裸鼠异种移植模型及肿瘤显示，肿瘤体积(K（K）)和肿瘤重量(L（左）)均进行了分析*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

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为了确定PELI1是否可以作为体内PTC治疗的潜在靶点，将稳定转染sh-PELI1或对照的PTC细胞（W3）皮下注射到裸鼠体内。所有裸鼠在注射部位都发生了异种移植瘤（图2J） ●●●●。如图所示2sh-PELI1组肿瘤的平均体积和重量显著低于sh-NC组。综上所述，这些发现表明PELI1作为癌基因发挥作用，促进PTC细胞的进展。

PELI1通过激活PI3K-AKT通路促进PTC细胞增殖和迁移

E3泛素连接酶通过调节信号通路影响肿瘤进展[24,25]. 为了探索PELI1如何在PTC中发挥其致癌活性，一份270个具有高Pearson相关系数值（＞0.5）的基因列表PELI1公司（称为共表达基因）从TCGA THCA数据库（附加文件1). 然后，我们使用KOBAS-I对这些基因进行KEGG分析(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)确定PELI1可能的下游信号通路。重要的是(P（P） < 0.001）富集途径与细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-AKT、TNF信号、癌症蛋白聚糖、MAPK、JAK-STAT、癌症途径、凋亡、NF-κB和癌症转录调控异常有关（图三A） ●●●●。在这些途径中，选择PI3K-AKT（箭头所示）进行进一步分析（图三A） ，因为有相对大量的共表达基因（例如BCL2L1型,YWHAZ公司,ITGB4型,ITGA9公司,CDKN1A公司等等；其他文件2)PI3K-AKT信号在甲状腺癌的发生和转移中起着关键作用[26,27]. 与对照细胞相比，在过度表达PELI1的细胞中，AKT磷酸化（p-AKT）蛋白水平上调，而在PELI1沉默的细胞中降低，但AKT总蛋白没有变化。此外，PI3K-AKT信号的下游效应器，包括Ki-67和MMP2总蛋白[28]与细胞增殖和迁移相关的，在PELI1过度表达的细胞中增强，但在PELI基因敲除的细胞中受到抑制（图三B） ●●●●。此外，来自sh-PELI1小鼠的肿瘤组织（与图2J） 与sh-NC组相比，p-AKT的表达较少（图三C） IHC染色结果显示，PELI1的敲除显著下调了Ki-67和MMP2（图三D） ●●●●。

图3
图3

PELI1激活PI3K-AKT信号通路。A类KEGG富集分析表明，与PELI1公司富含多种途径。B类通过western blotting检测PELI1过度表达或PELI1沉默PTC细胞中p-AKT、AKT、Ki-67和MMP2的蛋白水平。C类Western blotting分析显示小鼠肿瘤样本中PELI1和p-AKT的水平。D类来自小鼠肿瘤切片的Ki-67和MMP2的代表性IHC染色图片（左图），以及Ki-67和MMP2表达的定量（右图）（n=3）。比例尺表示50µm。E类PI3K/AKT抑制后PELI1过度表达PTC细胞的集落形成分析（LY294002；左侧面板），并显示定量（右侧面板；n=3）。F类采用Transwell分析法估计PI3K/AKT抑制后PELI1过度表达PTC细胞的细胞迁移，显示Transwell检测的代表性图像（×200）（左侧面板），并显示定量（右侧面板；n=3）。G公司通过western blotting检测LY294002处理后PELI1过度表达PTC细胞中PI3K/AKT的抑制效率以及Ki-67和MMP2的蛋白水平。这些数字表示为LV-NC组的倍数增加*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

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然后，我们通过使用LY294002（PI3K抑制剂）抑制PELI1过度表达PTC细胞中的PI3K/AKT通路[8]. 有趣的是，LY294002显著抑制了PELI1过度表达引起的PTC细胞增殖和迁移增强（图三E和F）。此外，PELI1过度表达的TPC细胞中Ki-67和MMP-2的蛋白水平降低（图三G） ●●●●。因此，PI3K/AKT信号通路对PELI1介导的PTC致癌功能至关重要。

MiR-30c-5p缺失诱导PTC中PELI1上调

为了阐明PELI1在PTC中增加的原因，首先，我们使用miRNA靶点预测软件TargetScan、PicTar和miRanda来识别潜在的miRNA靶向PELI1公司这三个数据库的交叉筛选了13个高度可靠的miRNAs。然后，我们使用StarBase数据库检查这13个miRNA在THCA中是否显著下调。分析后发现，在THCA中miR-30c-5p、miR-30a-5p、micR-301a-3p、micr-454-3p、mcr-374b-5p、mcR-194-5p和micr-153-3p显著下调，其余6个miRNA上调或无显著差异（图4A和附加文件三). 接下来，我们进行了StarBase泛癌分析，以验证PELI1公司这7种miRNA在THCA中显著下调。有趣的是，在这7个miRNAs中，miR-30c-5p与PELI1公司mRNA表达（图4B） ●●●●。因此，miR-30c-5p被视为关注焦点。然后，收集12对PTC组织（与图中相同的样本）1G） 研究miR-30c-5p表达与PELI1蛋白水平之间的关系。我们发现，与邻近正常组织相比，共有11个PTC样本的miR-30c-5p表达较低，其中一个表达较高（图4C） 和预期一样，miR-30c-5p水平与PELI1蛋白水平显著负相关（图4D） ●●●●。

图4
图4

PELI1是PTC细胞中miR-30c-5p的直接靶点。A类miRNAs靶向重叠PELI1公司在PicTar、miRanda和Targetscan中，以及在THCA的starBase数据集中，miRNAs显著下调。B类miR-30c-5p、miR-30a-5p、micr-301a-3p、micR-454-3p、miR-194-5p、microR-374b-5p、milR-153-3p和PELI1公司在THCA中使用starBase。C类实时PCR检测12对PTC组织中MiR-30c-5p。D类测量了12对PTC组织中miR-30c-5p与PELI1蛋白之间的关系。E类预测的miR-30c-5p靶序列（红色）PELI1公司3′-UTR。七个核苷酸（*）发生突变，以防止与miR-30c-5p结合。F类携带野生型或突变型报告质粒的相对荧光素酶活性PELI1公司与miR-NC或miR-30c-5p模拟物共同转染的PTC细胞中的3′-UTR（n=4）。44%和41%是一个实验中四个复本的平均还原值以及相应的P（P）-值分别为0.0147和0.004。G公司实时PCR分析PELI1公司在转染miR-30c-5p模拟物或miR-30c-5p抑制剂后24小时的PTC细胞中，与它们的阴性对照相比（n＝3）。H（H）western blotting分析miR-30c-5p模拟物或miR-30c-5p抑制剂转染后PTC细胞中PELI1的水平*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

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验证miR-30c-5p是否直接结合PELI1公司，我们进行了包含荧光素酶野生型3′-UTR序列（WT-PELI1公司-3′-UTR）或突变的3′-UTR序列（MT-PELI1公司-3′-UTR）（图4E） ，然后对PTC细胞进行双核糖核酸酶报告物分析。如图所示4F、 miR-30c-5p在野生型结构中显著抑制报告基因的荧光素酶活性（W3和TPC-1细胞中分别减少44%和41%），但在突变型结构中没有PELI1公司3′-UTR构造。然后，我们在PTC细胞中转染miR-30c-5p的模拟物或抑制剂，并检测miR-30c-5p对PELI1表达的影响。实时PCR结果（图4G） 和western blot（图4H） 结果表明，miR-30c-5p模拟物降低了W3和TPC-1细胞中PELI1的mRNA和蛋白质水平，而miR-30c-5p抑制剂增加了PELI1 mRNA和蛋白水平。总之，这些发现表明miR-30c-5p下调诱导PTC中PELI1上调。

miR-30c-5p过度表达可抑制PTC细胞增殖和迁移

然后，我们在体外研究了miR-30c-5p的生物学作用。CCK-8分析表明，过度表达miR-30c-5p的PTC细胞的增殖能力明显低于转染miR-NC的细胞（图5A） ●●●●。此外，与阴性对照组相比，miR-30c-5p的细胞集落数显著减少（图5B） ●●●●。此外，Transwell和伤口愈合试验表明miR-30c-5p转染导致细胞迁移能力减弱（图5C和D）。

图5
图5

MiR-30c-5p通过下调PELI1抑制PTC细胞增殖和迁移。A类CCK8法检测miR-30c-5p模拟物或其对照转染PTC细胞的细胞增殖（n=5）。B类对转染miR-NC或miR-30c-5p的PTC细胞进行集落形成分析，并显示集落形成的量化（n=3）。C类用miR-30c-5p转染的PTC细胞的Transwell测定的代表性图像，并显示了定量（n=3）。D类用miR-30c-5p转染的PTC细胞的划痕伤口愈合测定的代表性图像。E类通过western blot检测PELI1过度表达增加（oe-PELI1）的转染效率。F类集落形成分析表明，oe-PELI1可以部分逆转miR-30c-5p介导的PTC细胞增殖抑制（n=3）。G公司Transwell分析表明，oe-PELI1显著减轻了miR-30c-5p介导的PTC细胞迁移抑制（n=3）。H（H）western blot检测各组p-AKT、AKT、Ki-67和MMP2蛋白水平*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

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考虑到PELI1是miR-30c-5p的下游靶点，我们确定PELI1的恢复是否可以逆转miR-30c-5p介导的PTC细胞增殖和迁移抑制。通过转染PELI1 cDNA，增加了过表达miR-30c-5p的PTC细胞中PELI1的蛋白表达（图5E） 。我们的数据表明，PELI1（oe-PELI1）的过度表达显著削弱了miR-30c-5p的作用，从而显著增加了miR-30-5p过度表达PTC细胞的增殖和迁移（图5伴随p-AKT、Ki-67和MMP2蛋白的上调（图5H） ●●●●。因此，PELI1对于miR-30c-5p介导的PTC细胞增殖和迁移抑制至关重要。

来源于miR-30c-5p-修饰hUCMSC的EVs（miR-30c-5p-EVs）能有效抑制PELI1表达并抑制PTC进展

最近，EVs（纳米级膜囊泡），特别是来源于MSCs的EVs，被认为是将外源核酸输送到癌细胞中的新型有效药物载体[29,30]从而可能实现基于临床相关基因的癌症治疗策略。为了促进PTC中miR-30c-5p-PELI1-AKT轴的临床转化，我们将miR-30c-5p填充到hUCMSC-EV（miR-30c-5p-EVs）中，并进一步研究miR-30c/5p-EVs对PELI1表达和PTC进展的影响。

如图所示6A、 miR-30c-5p-EVs是圆形膜结合囊泡，平均直径为119nm，大小分布为50-300nm。Western blot显示，包括热休克蛋白70（HSP70）和肿瘤易感基因101（TSG101）在内的几个EV标记物[31]存在于这些囊泡中（图6B） ●●●●。正如预期的那样，与对照组（NC-EV）相比，miR-30c-5p-EV中miR-30c-5p水平显著增加（图6C） 证实miR-30c-5p已成功加载到hUCMSC-EV中。

图6
图6

来自miR-30c-5p-修饰hUCMSC的EVs（miR-30c-5p-EVs）下调PTC细胞中PELI1的表达。A类在透射电子显微镜下观察miR-30c-5p-EV和NC-EV（比例尺：200 nm），并使用纳米粒子追踪分析检测这些EV的尺寸分布。B类miR-30c-5p-EVs和NC-EV中TSG101和HSP70表达的Western blot分析。Ponceau S染色作为负荷控制。C类实时PCR检测miR-30c-5p-EVs和NC-EV中的相对miR-30c-5p水平（n=3）。D类使用激光共焦显微镜（标尺：20μm）评估荧光。E类与添加NC-EV的细胞相比，经miR-30c-5p-EVs处理的PTC细胞显示miR-30c-5p的表达显著增加（n=3）。F类,G公司实时PCR检测PTC细胞中PELI1的表达(F类)和Western印迹(G公司).H（H）western blot检测各组p-AKT、AKT、Ki-67和MMP2蛋白水平*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

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然后，我们用FAM-标记的miR-30c-5p转染hUCMSC，收集含有FAM-miR-30c-5p的EVs（称为miR-30c-5p-FAM-EVs），并用miR-30c-5p-FAM-EVs处理W3细胞。在荧光显微镜下，在暴露于这些miR-30c-5p-FAM-EV的W3细胞的细胞质中检测到绿色信号（图6D） 表明miR-30c-5p-EVs中的miR-30c-5p可以有效地转移到PTC细胞中。事实上，与NC-EV组相比，经miR-30c-5p-EVs处理的PTC细胞中miR-30c-5p水平显著增加（图6E） 。此外，经miR-30c-5p-EVs处理的PTC细胞中PELI1的mRNA和蛋白表达下调（图6F和G）。此外，与NC-EV组相比，miR-30c-5p-EV处理降低了PTC细胞中p-AKT、Ki-67和MMP2的蛋白水平（图6H） ●●●●。

然后，进行克隆形成和Transwell分析，以评估miR-30c-5p-EVs在体外对PTC致癌的影响。如图所示7与NC-EV组相比，A和B，miR-30c-5p-EV处理显著抑制PTC细胞的增殖和迁移。为了研究miR-30c-5p-EVs是否在体内抑制PTC细胞，将miR-30c-5p-EV通过瘤内注射给荷W3细胞的裸鼠。如图所示7与NC-EV组相比，经miR-30c-5p-EVs治疗的肿瘤体积和重量显著降低。鉴于MSC-EV对癌细胞具有多种作用[32]然后，我们研究了原始hUCMSC-EV对PTC癌变的影响，发现与PBS治疗组（对照组）相比，hUCMSC_EV治疗PTC细胞可显著减少体外增殖和迁移（图7A和B）和体内肿瘤体积和重量（图7C–E）。

图7
图7

MiR-30c-5p-EVs在体内外抑制PTC的进展。A类用集落形成试验检测各组PTC细胞的增殖情况（左面板），并计算集落数（右面板；n=3）。B类使用Transwell分析法测定各组的迁移特性（左面板）。放大倍率，×200。EVs处理的PTC细胞迁移细胞数量的集体分析（右侧面板；n=3）。C类植入后28天W3荷瘤裸鼠异种移植的代表性图像。D类,E类肿瘤体积的变化(D类)和重量(E类)在每个W3异种移植模型组中。F类实时PCR检测miR-30c-5p表达的变化。G公司的表达式PELI1公司实时PCR检测经miR-30c-5p-EVs治疗的小鼠肿瘤。H（H）Western blot分析显示肿瘤样本中PELI1和p-AKT的水平。我NC-EV和miR-30c-5p-EV组肿瘤切片上的Ki-67和MMP2免疫组织化学染色（上面板），以及Ki-67与MMP2表达的定量（下面板）。比例尺：50µm*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

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然后，miR-30c-5p和PELI1公司使用实时PCR检测肿瘤组织中miR-30c-5p的表达，我们发现与NC-EV组相比，miR-30c-5p的水平显著上调，而PELI1公司miR-30c-5p-EV组表达下调（图7F和G）。我们对小鼠肿瘤中PELI1和p-AKT的相对表达进行了western blot分析，发现miR-30c-5p-EV治疗的肿瘤与NC-EV治疗的肿瘤相比，PELI1及p-AKT水平降低（图7H） ●●●●。此外，IHC分析显示，与NC-EV组相比，miR-30c-5p-EV组的肿瘤切片中Ki-67阳性和MMP2阳性细胞较少（图7一） ●●●●。总之，这些结果表明，用miR-30c-5p模拟物处理的hUCMSC的EVs可以有效降低PTC中PELI1的表达并抑制PTC的进展。

讨论

作为一种E3泛素连接酶，PELI1有助于淋巴和几种固体（如肺癌、乳腺癌和黑色素瘤）的肿瘤发生[5,6,7,8,9,10]已被强调为有价值的预后生物标志物和有吸引力的癌症治疗靶点。然而，PELI1在PTC中的表达及其生物学功能尚不清楚。在这项研究中，我们首次证明了PTC肿瘤样本中PELI1的mRNA和蛋白水平普遍上调。此外，我们发现PELI1公司mRNA过表达与较大的肿瘤大小和淋巴结转移相关，这与TCGA数据库的结果一致，TCGA数据库中上调了mRNA的表达PELI1公司PTC患者与基-67淋巴结转移。这些数据表明，PELI1可能在PTC中起到预后标志物的作用。PELI1的异位表达促进了PTC细胞的增殖和迁移，而PELI1基因敲除在体外破坏了PTC的这些细胞行为。更重要的是，PELI1基因敲除抑制皮下肿瘤模型中的肿瘤生长，同时Ki-67和细胞转移标记物MMP2的表达降低。这些数据强烈表明PELI1参与了PTC恶性进展，是PTC的治疗靶点。然而，PELI1的表达及其在食管鳞癌中的作用最近被描述为相互矛盾的结果[11]可能主要是由于肿瘤类型、肿瘤微环境、动物模型等方面的差异。

PI3K/AKT通路与THCA的发展和进展密切相关，被认为是晚期THCA的新疗法[2,26,27]. 结合KEGG分析，用western blotting证实PELI1对PTC细胞和动物肿瘤中p-AKT的阳性调节。这些发现与Jeon的报告类似，即p-AKT在PELI1-过度表达的A549和H1299细胞中升高，但在PELI1-detached A549和H299细胞中降低[8]. 此外，在本研究中，我们发现p-AKT的抑制显著抑制了PELI1介导的PTC细胞的增殖和迁移，这进一步证实PELI1通过PI3K/AKT活化至少部分地促进了PTC的进展。然而，PELI1激活PTC细胞PI3K/AKT通路的机制尚待阐明。值得注意的是，最近的一项研究报告称，T细胞中PELI1缺乏并不影响AKT的激活[10]. 因此，PELI1在PI3K/AKT通路中的功能作用可能是细胞类型特异性的。

MiRNAs被认为主要通过结合目标转录物的3′UTR下调基因表达，因此通常被认为是基因和信号的微调器[12,13,14]. 到目前为止，还没有研究探讨肿瘤中miRNAs和PELI1之间的关系。基于生物信息学分析，我们认为miR-30c-5p的缺失可能会导致PTC中PELI1的积累，这后来被以下证据证实：首先，在PTC组织中观察到miR-30c5p与PELI1表达呈负相关。其次，荧光素酶活性测定表明miR-30c-5p可以与3′-UTR结合PELI1公司第三，miR-30c-5p反向调节PTC细胞中PELI1 mRNA和蛋白质的丰度。当然，这项研究并不排除其他miRNA也可能参与PELI1调节，因为一个mRNA可能同时被许多miRNA靶向[12]. 此外，我们首次揭示了miR-30c-5p在PTC中的生物学功能。我们证明，miR-30c-5p过度表达在体外抑制PTC细胞的增殖和迁移，这些抑制作用通过PELI1修复而部分消除。这些结果不仅支持miR-30c-5p是一种肿瘤抑制因子的观点[33,34,35,36,37]但也进一步证实了PELI1在PTC中的促肿瘤作用。

由于全身给药后细胞摄取和降解较差，将核酸输送到肿瘤中一直是一个挑战[38,39]. 虽然脂质体和基于病毒的递送系统已经过评估，但所有这些方法都显示出低效率[40]. 利用EVs作为生物载体来传递肿瘤抑制基因用于肿瘤治疗是一种新颖且有前景的方法[41,42]. 尤其是MSC非常适合大规模生产EV，这些EV非常适合基因传递[43,44]. 我们的小组和其他研究人员此前表明，MSC-EV可以有效携带外源性核酸，从而影响肿瘤细胞的进展[17,20,30,45]. 然而，针对PTC治疗的miRNA结合MSC-EV策略尚未探索。在这种情况下，我们选择人脐血间充质干细胞作为MSC衍生EV的来源，因为人脐血MSC比其他成人对应物具有更高的细胞活力、更高的可及性、更低的衰老和更少的伦理约束，是MSC临床应用的更好选择[46,47]. 结果表明：（1）miR-30c-5p-EVs能有效地向PTC细胞传递miR-30c-5p，降低PELI1的mRNA和蛋白表达，抑制PI3K/AKT通路；（2） miR-30c-5p-EVs体外抑制PTC细胞增殖和迁移；和（3）miR-30c-5p-EVs对BALB/c裸鼠模型中PTC肿瘤的生长有效，同时miR-30c-5p上调，PELI1、p-AKT、Ki-67和MMP2表达显著下调。总的来说，这些数据提供了强有力的证据，证明传递miR-30c-5p的工程化hUCMSC-EV能够有效抑制PTC中PELI1的表达和肿瘤进展，这在一定程度上促进了肿瘤治疗中miR-30c-5p-PELI1轴的临床转化。更重要的是，在本研究中，我们首先研究了原始hUCMSC-EV对PTC进展的影响，因为MSC-EV可能对癌细胞产生各种影响[32]. 我们发现hUCMSC-EV在体外显著降低PTC细胞的增殖和迁移，在体内抑制肿瘤生长。这些发现似乎支持了最近的观点，即MSC-EV不仅是通用的抗肿瘤药物输送平台，而且可以作为无细胞癌症治疗的替代方案[48]. 需要进一步研究才能完全阐明hUCMSC-EV在PTC中的作用和机制。

结论

据我们所知，本研究首次揭示了miR-30c-5p丢失诱导的PELI1积累通过激活PTC中的PI3K/AKT通路调节细胞增殖和迁移。此外，miR-30c-5p EVs可以有效下调PELI1的表达并抑制PTC的进展（图8). 这些发现可能为PTC或其他miR-30c-5p-PELI1异常疾病患者提供潜在的基于MSC-EV的新型治疗策略。

图8
图8

提出miR-30c-5p-EVs模型作为PTC癌治疗的新途径。PELI1在PTC癌中高表达，而miR-30c-5p表达较差。MiR-30c-5p通过负性介导PELI1的表达，抑制PTC细胞的增殖和迁移。MiR-30c-5p-EVs可显著下调PELI1的表达并抑制体外和体外PTC的进展活泼地伴随p-AKT、Ki-67和MMP-2表达降低

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