图b

介绍

心血管疾病目前是世界上男性和女性的主要死亡原因,每年导致1700多万人死亡[1]. 虽然目前的药物治疗减缓了心力衰竭的进展并改善了生存预后,但除了心脏移植外,唯一的治疗方法是用新的心肌细胞替换丢失的心肌细胞,这是再生心脏病学的最终目标[24]. 在过去的二十年里,各种干细胞被测试可以再生丢失的心肌细胞。结果有好有坏,其中包括最近关于特定类型干细胞的争议[567]. 尽管最近存在这种不确定性,干细胞治疗仍是治疗心血管疾病的一种有吸引力的治疗方法[8]由于干细胞的多因子特性。干细胞分泌旁分泌因子,这些因子不仅具有血管生成和细胞生存特性,而且还吸引内源性干细胞[910]. 有趣的是,大多数研究都确定了从糖尿病患者或糖尿病动物模型中收集的干细胞(包括心脏祖细胞)的治疗潜力受损[111213].

糖尿病个体或动物干细胞的病理生理学涉及多种机制,如胰岛素信号受损、氧化应激增加、线粒体功能障碍和异常表观遗传学改变[]. 然而,糖尿病干细胞疗效受损的确切分子机制尚不清楚。我们与其他人一样,在糖尿病心脏的早期阶段就已经显示出microRNAs(miRNAs)的显著失调[141516]. miRNAs是一种小分子(21-25核苷酸)非编码RNA分子,在转录后水平调节基因表达。最近,我们证明,糖尿病心脏早期miRNAs的失调为后期功能和结构异常的发展奠定了基础[171819]. 以往研究的证据支持miRNAs在干细胞生存、增殖和分化中的关键作用[20]. 然而,关于糖尿病对CPC中miRNAs的影响几乎一无所知。在本研究中,我们研究了糖尿病对miRNAs表达的影响,并确定了参与2型糖尿病小鼠模型和人类右心耳(RAA)心脏组织CPC存活和增殖的靶蛋白的后果。我们假设糖尿病将导致与干细胞生存、增殖和分化相关的miRNA的失调,并且这些miRNA的治疗性调节将提高人类和小鼠糖尿病CPC的生存率。

方法

详细方法见电子补充材料(ESM)方法

伦理学

新西兰健康与残疾道德委员会已批准收集人类RAA组织(健康志愿者道德参考:上南A道德委员会批准号:01/05/062)。所有志愿者提供了本研究组织采集和使用样本的书面同意书。人类样本的收集和使用也符合《赫尔辛基宣言》。所有使用小鼠组织的实验均已获得奥塔哥大学动物伦理委员会的批准(D25/12和AUP 18-205)。

小鼠和人CPC的分离

干细胞抗原-1阳性(Sca-1+)从10±1周龄男性糖尿病小鼠中分离出小鼠CPC(数据库/数据库[BKS公司。Cg-码头7m+/+ Leprdb/J公司])和之前描述的年龄匹配(±1周)的非糖尿病小鼠[11]. 动物在奥塔哥大学Hercus Taieri资源中心繁殖。肥胖的数据库/数据库作为2型糖尿病模型的小鼠(连同其非糖尿病瘦胎鼠作为对照)最能代表人类2型糖尿病,并且已被证明是研究糖尿病引起的心血管疾病的良好模型[1517182122]. 本研究中使用的所有动物都被安置在21±1°C的环境中,可以随意进食和饮水。

从糖尿病患者和年龄匹配(±3岁)的非糖尿病患者的RAA活检中分离出人CPC(n个 = 各6个,ESM表1)按照我们之前的描述,在书面和口头同意后,接受了体外循环冠状动脉搭桥手术[1123]. 实验者并没有对研究中使用的细胞类型视而不见。

形态学上,Sca-1+小鼠CPC在培养1周后表现出相似的形状,但横截面积也更大(ESM图。1a–c)。通过流式细胞仪分析特异标记的表达和免疫荧光分析来确认所得细胞的纯度,以排除成纤维细胞的污染(ESM结果和ESM图。1d、 e)[11]. 这些单元被进一步扩展用于下游应用。

利用纳米线微阵列和生物信息学分析进行miRNA表达谱分析

从糖尿病患者中提取总RNA(n个 = 6) 和非糖尿病小鼠CPC(n个 = 5) 按照制造商的说明使用QIAGEN miRNeasy Mini套件(美国QIAGEN)[1824]如前所述进行微阵列分析[25]. miRNAs的选择基于显著的折叠变化(第页 < 0.05)。

miRPath生物信息学工具(microT-CDS,版本5,DIANA TOOLS)[26]用于根据其在干细胞中的已知功能对差异调节的miRNA进行分类。四个独立的预测数据库(microT-CDS,版本5[26],miRDB,版本3[27],microRNA.org网站,版本1[28]和TargetScan,版本6.2[29])用于识别候选miRNAs的特定靶基因。

qPCR分析

选定的候选miRNAs(表1)如我们之前所述,通过定量实时PCR(qPCR)进行验证[151819]. 数据显示为DCT(\({2}^{-\Delta{\mathrm{C}}_{\mathr{t}}\))表达式。

表1糖尿病小鼠CPC中出现显著变化的miRNAs

蛋白质印迹分析

从糖尿病和非糖尿病小鼠和人类CPC中提取总蛋白(n个 = 每组4-5个),用SDS-PAGE分离,转移到PVDF膜上,并用ESM方法中详细说明的以下抗体进行探测[151819]:糖原合成酶激酶3β(GSK-3β,Novus Bio,NBP1-47470)、肌细胞特异性增强因子2C(MEF2C,Life Technologies,MA5-17119)、细胞周期依赖性激酶6(CDK6,Cell Signaling,13331S)、电压依赖性阴离子选择性通道1(VDAC1,Abcam,ab15895)和β-肌动蛋白(Novus Bio,NB-600-503)。使用Li-Cor Odyssey荧光带成像站或通过与增强化学发光底物的化学发光反应(Pierce Fast Western Kit,SuperSignal West Pico)对蛋白质进行可视化。目标蛋白表达正常化为β-肌动蛋白或总蛋白。

MS分析

由于使用可用的在线预测工具(详见结果第节),我们使用MS识别了前面描述的潜在miRNA靶点[30]. 两个靶基因,Vdac1型Cdk6型,被选为候选miRNA的最合适靶点(详见结果第节)。

荧光素酶检测

用含有野生型3′非翻译区(3′UTR)的pEZX-MT06 miR荧光素酶载体构建物(GeneCopoeia)联合转染小鼠CPC 48小时Vdac1型载体(MS确定为miR-30c-5p的直接靶点,在结果第节),突变型Vdac1型载体或野生型和突变型Cdk6型载体(阴性对照以确认对荧光素酶活性没有影响),并使用miR-30c-5p模拟物,或miRNA模拟加扰对照,或使用空荧光素素酶报告载体。转染48小时后测定荧光素酶活性。

miR-30c过度表达和Vdac1型击倒

第四代人和小鼠CPC转染miR-30c-5p模拟物(5 pmol/μl)或miRNA模拟扰码序列(5 pmol/μlVdac1型根据制造商的说明,使用lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher Scientific)的siRNA(6 pmol/μl)和阴性对照siRNA(6 pmol/μl)。miR-30c-5p的qPCR和VDAC1表达的western blot分析证实了转基因效果。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性测定

将第4代的糖尿病和非糖尿病小鼠和人CPC以1×10接种4细胞/孔在96 well板中复制10个,并如上转染。转染72小时后,如前所述测量胱天蛋白酶3/7活性[1719].

miR-30c-5p对线粒体膜电位(MMP)的保护作用

生长在玻璃盖玻片(1×10)上的糖尿病和非糖尿病小鼠CPC4电池/盖玻片)或96-well板(1×104细胞/孔)加载1μmol/l钙黄绿素-AM染料(Thermofisher Scientific),然后用1μmol/l CoCl处理2熄灭胞浆中的钙黄绿素。在37°C下培养15分钟后,使用荧光显微镜或平板阅读器测量荧光强度,对细胞成像[31].

糖尿病心脏体内miR-30c-5p的过度表达

探讨miR-30c-5p在老年(24周龄)2型糖尿病患者体内CPC功能恢复中的作用(数据库/数据库)在基线超声心动图检查后,小鼠(代表糖尿病的进展阶段)接受miR-30c-5p模拟物或加扰对照物注射(10 nmol/kg溶于0.2 ml生理盐水[154 mmol/l NaCl],s.c.,Exiqon,USA),以确认存在心脏功能障碍。通过生成一个随机值序列并将其与两个治疗组中的一个组匹配,对动物进行随机分组。老年人数据库/数据库本研究使用了患有心脏功能障碍的小鼠,以便我们将我们的发现应用于临床,因为大多数参加临床的患者已经出现了某种形式的心脏功能障碍。在超声心动图检查后的6周随访期结束时,采集血液样本和心脏组织。血液样本用于测量循环miR-30c-5p的水平。如上所述,通过流式细胞术分离和表征CPC。通过western blot分析检测miR-30c-5p对VDAC1表达的影响,并通过CyQUANT细胞增殖分析和casapase-3/7活性检测凋亡细胞死亡来确定存活率的提高。

统计

所有数据均表示为平均值±SEM。数据的正态性通过夏皮罗-威尔克检验得到证实。使用5%的错误发现率(使用Benjamini、Krieger和Yekitueli方法)来识别糖尿病和非糖尿病CPC之间显著不同的miRNAs。学生的t吨检验用于比较两组之间的统计差异,多组之间的所有比较均通过单向或双向方差分析、Bonferroni事后检验或Kruskal–Wallis检验(视情况而定)获得。A类第页小于0.05的值被认为是显著的。所有数据均使用GraphPad Prism 8.0(美国)进行分析。

结果

糖尿病-小鼠CPC中失调的miRNAs可调节其功能

在miRNA表达谱研究中评估的599个miRNA中,16个在糖尿病CPC中存在显著差异(表1). 完整的Nanostring数据集如ESM表所示2MiRPath软件预测,16个miRNAs中有7个显著改变,以调节与增殖和自我更新途径相关的信号通路(表2). 重要的是,七种miRNAs对增殖的影响与其在糖尿病CPC中的表达谱改变相关,预测miRNAss抑制增殖(miR-376c-3p、-329-3p、-495-3p、-19a-3p、-804和-365-5p)的表达上调。相反,唯一被预测能促进增殖的miRNA(miR-30c-5p)在糖尿病CPC中被下调(表12). 由于增殖和自我更新是干细胞的主要特性,因此选择了7个可能调控CPC功能的预测miRNA,通过qPCR分析进行进一步验证。

表2 miRNA对细胞增殖的预测影响

qPCR分析部分验证了Nanostring小鼠CPC数据

有趣的是,qPCR仅证实了四种miRNAs(miR-495-3p、miR-329-3p、miR-376c-3p和miR-30c-5p)的表达变化。1]). 通过qPCR验证这些miRNAs的失调表达,因此选择这些miRNAs作为候选miRNAss,以确定负责改变的miRNA的功能含义的靶蛋白。

图1
图1

小鼠CPC中候选miRNA的qPCR验证。定量散点图条形图显示了通过纳米线分析在糖尿病和非糖尿病小鼠CPC中识别的候选miRNAs的验证。所有数据均以平均值±SEM表示;n个 = 每组6人*第页 < 0.05, **第页 < 0.01和***第页 < 0.001 vs相应组中的非糖尿病CPC

使用MS在小鼠CPC中确定的新靶点并通过western blot分析验证

根据我们的初步分析,Gsk3βMef2c公司基因被预测为所有四种miRNA的靶点,而Mef2c公司预测为miR-329-3p、-376c-3p和-495-3p的靶点。GSK-3β和MEF2C调节与细胞增殖和细胞进展相关的信号通路(ESM图。2) [3233]. 然而,与我们的预测相反,western blot分析未能显示GSK-3β表达模式的任何变化(ESM图。a) 或MEF2C(ESM图。b) 在糖尿病CPC中。

因此,我们使用MS来识别候选miRNAs的新靶点。在MS评估的2000种肽中,435种(22%)在糖尿病CPC中显著失调。其中,10个显著失调的肽(8个下调,2个上调)构成了被预测为候选miRNAs靶点的蛋白质(表和ESM表). 细胞周期启动子CDK6[34]在四个数据库组合中预测为miR-329-3p、-495-3p和-376c-3p的靶点(miRDB、microT-CDS、,microRNA.org网站和TargetScan)(表). Western blot分析证实糖尿病CPC中CDK6显著下调(第页=0.04,图。2a个和ESM图。4a) ●●●●。

表3 MS预测候选miRNA靶点
图2
图2

小鼠CPC MS预测靶点的验证。(b条)显示CDK6表达的典型western blot图像和定量散点图条形图()和VDAC1(b条)在糖尿病和非糖尿病小鼠CPC中。数据表示为目标蛋白与总蛋白的比率,平均值±SEM,n个 = 每组4人*第页 < 0.05和**第页 < 0.01 vs非糖尿病。(c(c))显示荧光素酶活性的定量散点图条形图Vdac1型-和Cdk6型-3′UTR野生型和突变型荧光素酶构建物在存在或不存在miR-30c-5p-加扰(Scr)或-模拟物的小鼠CPC中表达。数据显示为相对荧光素酶活性归一化为野生型ScrVdac1型Cdk6型分别为平均值±SEM,n个 = 每组4人***第页 < 0.001与相应的Scr治疗组

促凋亡的VDAC1[35]在三个数据库(microT-CDS、TargetScan和microRNA.org网站)(表). Western blot分析证实VDAC1在糖尿病CPC中显著上调(第页 < 0.01,图。2亿和ESM图。4b) ●●●●。CDK6在干细胞增殖中起着至关重要的作用[34]. 然而,据我们所知,没有研究证明VDAC1在CPC中的作用。类似地,miR-30c-5p在CPC中的作用尚不清楚。因此,选择miR-30c-5p及其预测靶点VDAC1进行功能验证。

萤光素酶检测已确认Vdac1型作为小鼠CPC中miR-30c-5p的直接靶点

用miR-30c-5p模拟物转染小鼠CPC可降低野生型引起的发光Vdac1型-建造45±9%(第页 < 0.01,图。2厘米)确认VDAC1是miR-30c-5p的直接靶点。转染突变体的小鼠CPC的发光没有变化Vdac1型(图。3立方厘米). 突变型和野生型转染Cdk6型-结构没有显示出任何发光变化,验证了预测结果,即CDK6不是miR-30c-5p的直接靶点(图。2厘米).

图3
图3

miR-30c-5p对糖尿病小鼠CPC的治疗调节。将从非糖尿病和糖尿病小鼠分离的CPC转染Scr或miR-30c-5p模拟物(30c)()定量散点图条形图显示转染24小时后糖尿病和非糖尿病CPC中miR-30c-5p的表达显著增加。数据显示为与经Scr处理组相比的折叠变化n个=每组6人。(b条)典型的western blot图像和定量散点图条形图显示了经Scr或miR-30c-5p模拟治疗后糖尿病和非糖尿病CPC中VDAC1蛋白的表达。数据表示为VDAC1与总蛋白(A.U.)的比率n个 = 每组6人。(c(c)d日)显示转染小鼠CPC caspase-3/7活性的定量散点图(c(c))以及细胞增殖标记基因的mRNA表达Mki67型前2α(d日)在所有治疗组中。数据以发光单位表示(c(c))和相对DCT(\({2}^{-\Delta{\mathrm{C}}_{\mathr{t}}\))中的表达式(d日);n个 = 每组4人。(e(电子))代表性荧光显微镜图像和定量散点图条形图显示了细胞中钙黄绿素的积累作为细胞活力的衡量标准;n个 = 每组12人。比例尺,50µm。(如果)定量散点图条形图显示MMP作为所有研究组荧光强度的测量值。数据以A.U.表示n个 = 每组5人。所有数据均为平均值±SEM*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001与相应的非糖尿病组相比;第页 < 0.05和†††第页 < 0.001与相应的Scr治疗组\({2}^{\hbox{--}\Delta{\mathrm{C}}_{\mathrm{t}}\)

miR-30c-5p的过度表达通过下调VDAC1减少糖尿病小鼠CPC的凋亡细胞死亡

VDAC1在线粒体介导的凋亡细胞死亡中起主要作用[35]糖尿病加速干细胞凋亡[1936]. 据此,在糖尿病和非糖尿病CPC中转染miR-30c-5p(图。3a年)诱导糖尿病患者VDAC1蛋白显著下调(0.43±0.04任意单位[A.U.],第页 = 0.03)和非糖尿病CPC(0.33±0.04 A.U。,第页 = 0.002)与紧急处理的对照CPC相比(糖尿病患者为1.91±0.27 A.U.,非糖尿病患者为0.58±0.04 A.U.)(图。3亿和ESM图。5). 此外,miR-30c-5p的过度表达导致糖尿病CPC中caspase-3/7活性降低40±8%(第页 < 0.01,图。3立方厘米)但在非糖尿病CPC中没有。凋亡减少与细胞增殖增加无关,因为增殖标记基因M没有差异67岁以下儿童前2α在任何一组中(图。三维).

miR-30c-5p在糖尿病小鼠CPC中拯救MMP

我们的下一个目标是确定miR-30c-5p的过度表达是否可以保护MMP,因为VDAC1允许代谢物穿过线粒体外膜,从而对MMP进行负调控[35]. 荧光图像显示,CoCl治疗后,糖尿病CPC中的钙黄绿素密度显著降低2表明糖尿病CPC中存在开放状态或泄漏的线粒体通透性转换孔(PTP),从而允许CoCl2以猝灭线粒体中的钙黄绿素,表明MMP减少(图。第3e条,第f条). 然而,带有miR-30c-5p的小鼠CPC的过度表达恢复了糖尿病CPC中的MMP(图。第3e条,第f条). 此外,击倒Vdac1型概述了与miR-30c-5p过度表达相关的前生存效应,证实VDAC1是miR-30c-5p相关有益效应的潜在信号机制(图。4和ESM图。6).

图4
图4

Vdac1型敲除降低糖尿病小鼠CPC的细胞凋亡。()定量散点图条形图,显示Vdac1型qPCR基因表达;n个 = 每组4人。数据表示为相对DCT(\({2}^{-\Delta{\mathrm{C}}_{\mathr{t}}\))表达式。(b条)典型的western blot图像和定量散点图条形图显示糖尿病和非糖尿病小鼠CPC中VDAC1表达的折叠差异Vdac1型siRNA(siRNA);n个 = 每组4人。数据以VDAC1和总蛋白(A.U.)的比率表示。(c(c))显示所有治疗组caspase-3/7活性的定量散点图条形图。数据以发光单位表示;n个 = 每组6人。所有数据均为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01和***第页 < 0.001与相应的非糖尿病组相比;第页 < 0.05,††第页 < 0.01和†††第页 < 0.001与相应的Scr治疗组

体内miR-30c-5p过度表达可减轻糖尿病对CPC的有害影响

为了确定体外结果是否可以在体内环境中再现,老年糖尿病小鼠接受注射前miR-30c-5p模拟物(图。5a级). qPCR分析证实miR-30c-5p在模拟治疗动物的循环和CPC中的表达显著增加(图。5b、c). 这与VDAC1的显著下调有关(图。5天和ESM图。7). 流式细胞术分析显示,用模拟物治疗的糖尿病心脏中的CPC数量显著增加(图。第5页). CyQUANT分析显示CPC的增殖显著增加(图。5英尺)而caspase-3/7分析显示凋亡细胞死亡显著减少(图。5克)在从miR-30c-5p前体治疗的糖尿病小鼠分离的CPC中。基线超声心动图证实糖尿病小鼠在治疗前存在心脏功能障碍(表4和图。5小时,我). 虽然用miR-30c-5p模拟物治疗糖尿病小鼠后,收缩功能没有显著改善,但舒张功能有显著改善(E/a比,表4和图。第5页).

图5
图5

体内miR-30c-5p过度表达可减轻糖尿病对CPC的有害影响。()用于体内实验的实验方案。W、 周/周。(b、 c(c))定量散点图条形图显示miR-30c-5p在循环中的表达模式(b条n个 = 每组8个)和CPC(c(c)n个 = 每组5人)。数据表示为相对DCT(\({2}^{-\Delta{\mathrm{C}}_{\mathr{t}}\))表达式。(d日)Western blot图像和定量散点图显示糖尿病和非糖尿病小鼠CPC经miR-30c-5p模拟或干扰(Scr)治疗后VDAC1的表达;n个 = 每组8个。数据以VDAC1和总蛋白(A.U.)的比率表示。(e(电子))显示Sca-1百分比的流式细胞术散点图图像和定量散点图条形图+各组细胞;n个=非糖尿病Scr治疗组(ND-Scr)和n个 = 在糖尿病Scr(D-Scr)和模拟(D-mimo)组中为7。(如果)显示扩散的定量散点图条形图(如果)和caspase-3/7活性()在所有治疗组中。数据表示为折叠变化与初始播种密度(如果)或发光单位();n个 = 每组6人。(小时)显示射血分数的定量线图(小时)和E/A比率()各组在基线检查时和治疗6周后;n个 = 每组8个。所有数据均以平均值±SEM表示(b–g) *第页 < 0.05, **第页 < 0.01和***第页 < 0.001 vs ND Scr治疗组;††第页 < 0.01和†††第页 < 0.001 vs D Scr治疗组(小时) ***第页 < 0.001与ND Scr治疗组在相应时间点的比较;†††第页 < 0.001 vs相应时间点的D Scr治疗组;‡‡第页 < 0.01 vs基线;第页 = D Scr组与D模拟治疗组的差异为0.06(小时). 回声、超声心动图;D、 糖尿病;模拟,miR-30c-5p模拟;ND,非糖尿病;Scr,Scrame(紧急呼叫)

表4基线检查和治疗6周后的心功能

糖尿病诱导人CPC靶向miRNAs失调

最后,为了确定小鼠CPC的结果是否可以转化为临床结果,我们对人类CPC进行了验证研究。qPCR分析证实miR-376c-3p和miR-495-3p显著上调(第页 < 0.05)和下调miR-30c-5p(第页 < 0.01),而miR-329-3p表达保持不变(图。第6页). Western blot分析证实CDK6下调(图。6b条和ESM图。8)以及糖尿病CPC中VDAC1的上调(图。第6页c和ESM图。9). 与小鼠CPC类似,miR-30c-5p的过度表达显著降低了VDAC1的表达(图。6天和ESM图。10)和caspase-3/7活性(图。第六版)在糖尿病患者的CPC中。

图6
图6

候选miRNAs和靶蛋白在人类糖尿病CPC中的表达和修饰。()定量散点图条形图显示qPCR候选miRNA的表达模式;n个 = 每组6人。数据表示为相对DCT(\({2}^{-\Delta{\mathrm{C}}_{\mathr{t}}\))表达式。(b条c(c)). 显示CDK6的代表性蛋白质印迹图像和定量散点图条形图(b条)和VDAC1(c(c))糖尿病和非糖尿病人CPC中的蛋白质表达;n个 = 每组5人。数据以CDK6的比率表示(b条)或VDAC1(c(c))和总蛋白(A.U.)。(d日)典型的western blot图像和定量散点图条形图显示了糖尿病和非糖尿病人CPC在使用Scr或miR-30c-5p模拟物治疗后VDAC1的表达;n个 = 每组6人。数据以VDAC1和总蛋白(A.U.)的比率表示。(e(电子))显示所有治疗组caspase-3/7活性的定量散点图条形图。数据以发光单位表示;n个 = 每组6人。所有数据均以平均值±SEM表示*第页 < 0.05, **第页 < 0.01和***第页 < 0.001与相应的非糖尿病组相比;第页 < 0.05和††第页 < 0.01 vs相应的Scr治疗组

讨论

据我们所知,这是首次研究显示糖尿病CPC中miRNAs与细胞增殖和存活相关的差异调节。我们的体外和体内研究表明,对糖尿病CPC中的miRNAs进行治疗性调节可以提高其功能疗效。

在当前的研究中,我们使用了小鼠和人类心脏的异质细胞群。Sca-1型+细胞代表一个异质的群体,具有CPC的特征,包括心肌特异性转录因子的表达和端粒酶活性[113738]. Sca-1的直接移植+单元格[39]或用Sca-1分泌体治疗+单元格[40]在心肌梗死小鼠模型中显示出心脏功能的显著改善。我们研究中使用的异种人类CPC显示出与Sca-1相似的特征+群体,在体外培养时表达间充质表面标记物和CPC特征[2341]. 与其他研究相比,我们在从幼年小鼠分离的CPC中未发现糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠CPC的生长速度(增殖)有任何显著差异,这可能是糖尿病CPC生长速度没有差异的原因,尽管这在CPC中与老年糖尿病小鼠中有所不同(如下所述)。为了支持这一点,我们之前的研究显示,从20周龄糖尿病小鼠中收集的糖尿病CPC增殖减少[11]. 糖尿病患者CPC中的凋亡活性显著增加,这进一步证实了这一观点。因此,我们研究中失调的miRNAs很可能在后期产生功能性影响。

我们关注与细胞增殖、分化和存活相关的miRNA,因为这些是干细胞的特征。因此,在糖尿病小鼠CPC中显著改变的16个miRNA中,我们选择了7个与细胞存活、增殖和分化相关的miRNA。有趣的是,尽管有报告表明纳米线微阵列比其他技术具有更高的灵敏度,但在七种选定的miRNA中,只有四种miRNA(miR-329-3p、-376c-3p、-495-3p和-30c-5p)能够证实miRNA表达的变化[42]. 对人类CPC的研究表明,三种miRNAs(miR-30c-5p、-376c-3p和-329-3p)存在类似的失调,但miR-329-3p在人类糖尿病CPC中保持不变。虽然这种差异的确切原因尚不清楚,但可能所有糖尿病患者都在接受口服降糖剂或胰岛素治疗,这可能使miR-329-3p的变化正常化或延迟,尽管需要进一步研究。

在四种已验证的miRNAs中,miR-329已被证明与血管生成受损有关,并且miR-328的敲除增加了内皮细胞的增殖[43]. 为了支持这一观察,我们的生物信息学分析预测miR-329-3p抑制细胞增殖(表2). 关于miR-376c-3p和miR-495-3p功能作用的现有证据有限。miR-376c的过度表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖,同时抑制了成骨细胞的分化[44]. 同样,miR-495的表达增加抑制了间充质干细胞的增殖[45].

到目前为止,还没有证据表明miR-329-3p、-376c-3p和-495-3p在心肌细胞或CPCs中表达。为了支持这一点,我们也未能检测到这三种miRNA在正常人心室肌细胞中的表达(ESM图。11). 然而,糖尿病CPC中这些miRNA的显著上调表明,高血糖状态可能会激活CPC中的这些miRNA,从而对其功能功效产生不利影响。糖尿病CPC中预测靶CDK6的显著下调进一步支持了这一点。CDK6是一种40kDa的丝氨酸-苏氨酸激酶,可刺激细胞周期的G1/S期以促进细胞增殖。研究表明CDK6在干细胞增殖中的作用[34]. 在实验动物模型中,细胞周期蛋白D2(CDK6的激活物)的敲除可诱导胰岛素抵抗,从而导致糖尿病。另一项研究表明,prosenescent miR-34a直接靶向CDK6,我们之前的研究发现糖尿病心脏中miR-34b显著上调[1946]. 总之,我们的结果表明,糖尿病诱导的CPC中miR-329-3p、-376-3p和-495-3p的激活可能通过下调其靶基因来抑制其增殖Cdk6型

miR-30c是高度保守的miR-30家族(miR-30a–e)的五个成员之一,具有85%的序列相似性。它是一种源自miR-30c-1和miR-30c-2基因的mirtron,这些基因在人类和小鼠的内含子序列中编码。与其他三种miRNAs不同,miR-30c已被证明由心肌细胞表达[47]. 研究表明心肌梗死和缺血再灌注后心脏miR-30c显著下调[47]. 重要的是,从糖尿病患者采集的心脏组织中已经证实miR-30c下调,这与我们目前的研究结果一致,即糖尿病小鼠和人类CPC中miR-30c显著下调[48]. 我们的研究确定Vdac1型作为miR-30c-5p的一个新的直接靶点,它在糖尿病小鼠和人CPC中显著上调。VDAC1是线粒体PTP的一个组成部分,PTP的开放触发凋亡细胞死亡。PTP的开放还允许钙离子扩散到线粒体,导致钙超载和活性氧的积累,导致MMP的丢失[49]. 这在我们的研究中是正确的,该研究显示糖尿病小鼠CPC中MMP受损。重要的是,通过miR-30c-5p的过度表达下调VDAC1和保护MMP,以及通过直接敲除Vdac1型,证明VDAC1参与miR-30c-5p诱导的保护作用的下游机制。

用miR-30c-5p对糖尿病小鼠进行体内治疗可提高CPC的增殖和存活率。这很有趣,因为如上所述,在体外过度表达miR-30c-5p后,我们没有观察到糖尿病CPC的增殖(生长率)发生任何变化,这可能是由于我们实验中使用的CPC的年龄不同所致。体外研究使用从10周龄未表现出心脏功能障碍的小鼠中收集的CPC,而体内研究则在24周龄已表现出心脏功能异常的小鼠中进行。由于参加糖尿病/内分泌或心脏病诊所的大多数患者年龄较大,并且表现出某种形式的心脏功能障碍,因此使用老年动物进行体内研究。在用miR-30c-5p模拟物治疗糖尿病小鼠后,我们没有观察到收缩功能受损的明显改善。这可能归因于我们研究的短期随访性质。除了在CPC中表达外,miR-30c-5p也在心肌细胞中表达,表现出抗凋亡作用[48]. 因此,体内注射miR-30c-5p模拟物后观察到的有益影响,尤其是与心脏功能相关的影响,可能是通过改善心肌细胞存活率来实现的。未来的研究需要确定mIR-30c-5p模拟治疗对心脏其他类型细胞的影响。

虽然我们在不以CPC为靶点的情况下向糖尿病动物输送miR-30c-5p的方法没有显示出任何明显的不良反应,但考虑CPC定向输送miRNAs的其他可能模式很重要。这可以通过将miRNAs与CPC特异性启动子或受体结合来实现,从而将miRNAs特异性地传递给CPC。

综上所述,我们的研究结果新近证实,糖尿病会导致三种与干细胞存活和增殖相关的miRNA(miR-30c-5p、-376c-3p和-329-3p)的失调。这与细胞增殖激活物CDK6(miR-30c-5p、-329-3p和-376c-3p的靶点)的显著下调和促凋亡VDAC1的上调有关,我们将其确定为miR-30c-5p的新靶点。用miR-30c-5p对小鼠(体内外)和人(体外)糖尿病CPC进行治疗性调节,显著减少凋亡细胞死亡和基质金属蛋白酶的丢失。此外,miR-30c-5p对人类CPC的保护作用为需要进行更大规模的临床研究奠定了坚实的基础。总之,我们的结果表明,修改miRNA表达可能是提高糖尿病CPC治疗潜力的有效途径。然而,需要进行进一步的长期体内研究,以便将这种新疗法应用于临床。