摘要
肿瘤中肿瘤干细胞（CSC）的存在和上皮-间充质转化（EMT）的诱导与肿瘤的侵袭性、转移、耐药性和预后不良有关，因此需要开发用于明确检测肿瘤标本中CSC和EMT相关蛋白的试剂。为此，我们产生了针对EMT和CSC相关蛋白的新型抗体，包括Goosecoid、Sox9、Slug、Snail和CD133。重要的是，与几种广泛使用的CD133抗体不同，我们生成的抗CD133的抗体识别已知糖基化位点远端的表位，从而进行不受CD133糖基化差异影响的分析。对于所有靶蛋白，我们选择的抗体通过Western分析产生预期的靶蛋白分子量，并通过免疫荧光显微镜分析（IFA）获得正确的亚细胞定位模式；结合选择性通过免疫沉淀-质谱、免疫组织化学和IFA肽阻断实验验证。最后，我们应用这些试剂通过IFA评估异种移植瘤模型中EMT和CSCs各自标记物的调节。我们观察到人类肝细胞生长因子（hHGF）在H596非小细胞肺癌纯合移植瘤的肿瘤微环境中的组成性存在肝细胞生长因子敲除转基因小鼠诱导了更多的间充质样肿瘤状态（相对于植入对照SCID小鼠时的上皮样状态），我们的新抗体检测到的EMT相关转录因子的表达升高证明了这一点。同样，我们的新抗CD133抗体能够检测和定量CSC/黏着斑激酶抑制剂VS-6063治疗SUM149PT三阴性乳腺癌异种移植模型后药物诱导的CD133阳性肿瘤细胞减少。因此，我们针对CSC-和EMT-相关因子的新型抗体显示出足够的敏感性和选择性，用于免疫荧光显微镜研究临床前异种移植瘤标本中的这些过程，并具有应用于临床标本的潜力。
引文：Navas T、Pfister TD、Colantonio S、Aziz A、Dieckman L、Saul RG等（2018）新型抗体试剂，用于表征药物和肿瘤微环境诱导的上皮-间充质转化和肿瘤干细胞变化。公共科学图书馆·综合13（6）：1993年10月61日。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199361
编辑：韩国首尔国立大学药学院，Jung Weon Lee
收到：2018年1月24日；认可的：2018年6月6日；出版：2018年6月21日
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数据可用性：所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。编码全长或截短靶蛋白的质粒可通过DNASU储存库获得(https://dnasu.org/dnasu网站). 本手稿中描述的所有抗体亚克隆可通过爱荷华大学的发育研究杂交瘤库获得(http://dshb.biology.uiowa.edu/)和NCI癌症抗体门户临床蛋白质组技术(https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal网站/).
资金：该项目全部或部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的联邦资金资助，合同编号为HHSN261200800001E。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。这项研究（部分）得到了NIH、国家癌症研究所、癌症研究中心的院内研究计划的支持。这项研究（部分）得到了美国复苏和再投资法案基金的支持。弗雷德里克国家癌症研究实验室由联邦政府资助，由Leidos Biomedical Research，Inc.运营，该实验室以工资的形式为作者T.N.、T.D.P、S.C.、R.G.S.、J.K.、G.W.、A.A.、L.D.、R.J.K.和R.E.P.Leidos生物医学研究提供支持，Inc.是Frederick National Laboratory运营的主承包商，因此不得从事与本合同存在利益冲突的任何业务。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
竞争利益：T.N.、T.D.P、S.C.、R.G.S.、J.K.、G.W.、A.A.、L.D.、R.J.K.和R.E.P.隶属于Frederick National Laboratory for Cancer Research，并以工资的形式获得支持，该实验室由联邦政府资助，由Leidos Biomedical Research公司运营。这并不会改变我们对所有PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。
介绍
表型可塑性对肿瘤的增殖和扩散至关重要，使恶性细胞能够保持粘附的、上皮样的状态，促进肿瘤生长，并能够转换为支持转移和新肿瘤种植的活动的、间充质样的状态。肿瘤组织中的这种上皮-间充质转化（EMT）通常被认为与转移、预后不良和耐药性有关，尽管最近有人提出“混合”或“部分”上皮-间质肿瘤细胞表型（而不是转化为完全间充质表型）在某些肿瘤类型中可能更强烈地显示出侵袭性和耐药性[1——4]. 同样，肿瘤干细胞（CSC）的表型可塑性使其能够播种新的肿瘤并在治疗干预下存活下来，以促进肿瘤再生。虽然EMT和获得CSC样特性之间的确切关系尚未完全了解，并且由于遗传和微环境差异，肿瘤之间可能存在差异[5]这两种过程的临床意义保证了试剂的发展，以检测和定量与每种过程相关的关键蛋白，从而进一步表征EMT如何影响肿瘤细胞中的干细胞，反之亦然。
为了解决能够特异性检测EMT和CSC相关蛋白上已知表位的抗体试剂不足的问题，我们确定了这两个过程中涉及的几个目标蛋白，而在研究群体中，对高质量抗体试剂的需求尚未得到满足。这些靶蛋白包括EMT-/间质相关转录因子Goosecoid（GSC）、Sox9、Slug和蜗牛，以及CSC标记CD133(S1表). 虽然目前存在针对这些因素中每一种的市售抗体，但这些抗体通常识别未知或专有的表位序列(S2表). 表位信息的缺乏使基于抗体的分析复杂化，因为生物变量（包括翻译后修饰的变化和不同剪接亚型的存在）和技术变量（例如，使用的变性剂和培养时间）可能会改变抗体结合表位的可用性[6,7]; 当表位未知时，由于表位可用性问题导致的错误结果更难预测和检测。例如，针对未知表位AC133和AC141的经典、广泛使用的CD133抗体的表位识别受到糖基化模式和/或蛋白质构象差异的影响，这些抗体的使用导致假阴性，尽管CD133细胞表面有大量表达，但抗体结合仍丢失[7——9].
后续开发和在体外验证我们的新抗体，我们在免疫荧光显微镜分析（IFAs）中使用这些试剂来评估药物治疗或肿瘤微环境调节后异种移植物模型中EMT相关转录因子和CSC标记物表达的变化。在后一种情况下，我们利用HGF/Met信号在诱导EMT中的已知作用[10]并将EMT转录因子（TF）在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中生长的人类非小细胞肺癌（NSCLC）H596肿瘤中的表达与植入含有纯合子人类高血糖(肝细胞生长因子)敲入突变。肝细胞生长因子敲除H596模型由于小鼠基质细胞分泌hHGF而表现出肿瘤快速生长和构成肿瘤EMT，从而增强肿瘤HGF/MET信号[11]; H596肿瘤特别容易接受HGF分泌增强，因为存在遇见抑制蛋白酶体介导的MET降解的外显子14−跳跃突变[12]. 要验证体内利用我们的CSC标记CD133抗体，我们比较了用载体或CSC靶向黏着斑激酶（FAK）抑制剂VS-6063（defactinib；原名PF-04554878）治疗的SUM149PT三阴性乳腺癌（TNBC）异种移植模型[13]. 总之，这些实验证明了我们的新型抗体适用于EMT和CSC相关肿瘤细胞可塑性的临床前研究；我们相信这些试剂的可用性有助于解决可塑性在肿瘤生长、转移和治疗抵抗中的作用这一重要的悬而未决的问题。
材料和方法
重组蛋白的克隆、表达和纯化
质粒克隆从DNASU质粒库（亚利桑那州立大学）获得，或之前在马萨诸塞州剑桥麻省理工学院Robert Weinberg博士的实验室中生成。使用快速引物工具设计靶基因扩增的引物[14]和从综合DNA技术（IDT）获得。将扩增子克隆到pMCSG7载体中，以使N-末端6X组氨酸标记的蛋白质能够表达。使用C.Sanville Millard等人的方法在2-L塑料瓶中进行His标记表达克隆的大规模培养[15]. 可溶性蛋白质是通过先前描述的方法分离出来的[16]. 编码全长或截短靶蛋白的质粒可通过DNASU储存库获得(https://dnasu.org/dnasu网站).
可溶性蛋白的表达和纯化遵循结构基因组学联合会等描述的一套通用方法[17]. 表达的大多数蛋白质和蛋白质结构域是不溶性的，因此采用包涵体分离方法进行纯化。将颗粒重新悬浮在细菌蛋白提取试剂（B-PER，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）中，并在室温下培养30分钟，然后在冰上培养10分钟，以50 RPM的转速摇晃。添加稀释的B-PER试剂（水中1:10），对悬浮液进行超声处理3分钟（打开5秒，关闭5秒），然后在4°C下进行10分钟的培养。细胞裂解物在4°C下以34540 x离心30分钟克，将细胞颗粒倾析并用1:10 B-PER洗涤两次。第三次离心后，将颗粒重新悬浮在25 mL溶解缓冲液中（8 M尿素，50 mM Tris pH 8.0）。将溶解的颗粒在室温下培养30分钟，然后在45°C下培养10分钟，并在34540 x克.在SDS-PAGE上测试产生的含有分离包涵体的上清液的纯度。当需要进一步纯化时，使用尺寸排除色谱法。
用于肽阻断实验的CD133结构域A（氨基酸残基295–328，分子量3856 kD）和结构域B（氨基酸残基615–643，分子量3403 kD）肽(S3表)表达为牛血清白蛋白（BSA）结合物，并使用含有6 M尿素的Tris缓冲液从包涵体中纯化。将肽逐步透析为4M尿素，然后是2M尿素，最后是磷酸盐缓冲液（PBS），然后进行浓缩。
抗原设计和生产
基于预测的与其他靶标的最小交叉反应性来选择每个蛋白质靶标内的感兴趣区域；特别是，避免了高度保守的DNA结合域。然后使用具有表面暴露和/或初始序列中预测抗原性高的短序列来生成肽抗原。肽抗原与锁孔帽贝血蓝蛋白（KLH）或卵清蛋白（OVA）载体蛋白结合用于免疫或与BSA结合用于筛查。
免疫和血液筛查
对于每种目标蛋白，通过4-5次初始皮下注射和每只兔子两次试验出血对两只3个月大的新西兰白兔进行免疫。每个目标蛋白组的两只兔子的滴定度首先由Abcam（以前称为Epitomics；加州伯林盖姆）测定使用比色酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BSA结合肽或重组蛋白。国家癌症研究所（NCI）Frederick使用LI-COR平台独立确认了标题；简单地说，ELISA板在4°C下用100 ng抗原每孔在pH 9.6的0.1 M碳酸盐缓冲液中涂布过夜。用LI-COR Odyssey Blocking缓冲液（LI-COR，分类号：927–40010）封闭平板，然后添加样品并在24°C下培养2小时。用山羊抗兔IR-680作为二级抗体，在LI-COR Odyssey扫描仪上在700 nm处读取平板。对于每个靶蛋白，选择滴度较高的兔子进行脾切除术和融合。
脾切除、融合和杂交瘤筛查
分离脾细胞，将其与伙伴细胞融合，并在Abcam将其镀在96-well板上。在标准条件下培养平板，并使用标准比色ELISA筛选杂交瘤上清液，以对抗上述BSA结合肽或蛋白质。光密度＞0.5的克隆被认为是阳性的，并进一步扩展到24孔板。在Abcam进行初始亚克隆筛查（ELISA和Western blot），并将每个靶点的12个最有希望的阳性杂交瘤上清液从Abcam运送到Frederick的NCI，在那里进行额外筛查。
亚克隆、亚克隆筛选（Western和IFA）和抗体生产
利用有限细胞稀释法用Abcam进行亚克隆。NCI在Frederick对亚克隆进行了筛选。使用Western blotting进行初步筛选；使用Novex系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）在150V的1X 3-（N-吗啉）丙磺酸（MOPS）缓冲液中，在4–12%的SDS-PAGE凝胶上分离肿瘤细胞裂解物或重组蛋白，然后使用iBlot系统（Thermal Fisher科学）转移到硝化纤维素膜。用LI-COR封闭缓冲液封闭斑点，并用杂交瘤上清液（稀释1:30）培养过夜。使用LI-COR山羊抗兔IR-680抗体进行检测，并使用LI-COR-Odyssey扫描仪在700 nm处读取平板。
亚克隆也通过免疫荧光显微镜检查。根据下述方法制备福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）细胞颗粒https://ncifrederick.cancer.gov/rtp/lasp/phl/immuno人体组织（胰腺、结肠、皮肤、精原细胞瘤）购自Pantomics。，公司（CA）。用兔单克隆抗体和4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对载玻片进行染色，并使用抗兔−Alexa Fluor（AF）488作为二级抗体。抗体在无血清培养基中产生，并通过Abcam进行基于蛋白A的纯化。本手稿中描述的所有抗体亚克隆可通过爱荷华大学的发育研究杂交瘤库获得(http://dshb.biology.uiowa.edu/)和NCI癌症抗体门户临床蛋白质组技术(https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal网站/).
抗体选择性的免疫沉淀质谱分析
用500μM辛基-β-葡萄糖苷（“PBS/BOG”）将单克隆抗体在1X PBS（0.1 M磷酸盐，0.15 M NaCl）中稀释至50 ng/μL，并将测试蛋白或肽在PBS/BOG中稀释至100 ng/μL（全长蛋白或结构域）或25 ng/μL.（肽）。Dynabeads Protein A磁珠悬浮液（Invitrogen Corp.，Campbell，CA）在PBS/BOG中稀释1/4（v/v），并将200μL稀释后的悬浮液转移到96 well板的每个孔中。磁粉浓缩器用于促进去除、清洗和洗脱步骤。抗体（200μL/孔）与蛋白A珠在室温下孵育1小时，轻轻混合。然后将珠洗三次，并添加抗原溶液（200μL/孔）。在4°C下培养过夜后，用200μL PBS/BOG清洗珠子三次，然后用HPLC颗粒水清洗三次。通过在HPLC颗粒水中添加20μL 0.2%三氟乙酸溶液，从珠中洗脱结合肽或蛋白质。将洗脱液直接点在基质辅助激光解吸/电离（MALDI）靶的表面上（每个点0.5–1μL），并与适当的基质溶液混合在平板上。分别使用α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）或芥子酸（SA）MassPREP MALDI矩阵（Waters Corporation，Milford，MA）进行肽或蛋白质分析。在转移到质谱仪之前，在室温下干燥板材。
在反射器模式下使用Bruker Ultraflex III MALDI-TOF/TOF进行肽分析，并使用FlexAnalysis软件进行数据分析。蛋白质分析在配备CovalX HM-1高质量检测器的Applied Biosystems Voyager-DE Pro飞行时间质谱仪上进行，并在正离子条件下以线性模式运行；使用Voyager仪器中嵌入的“data Explorer”软件进行数据分析。
细胞系
如前所述，生成并培养HMLE、HMLE-GSC、HMLE-Slug、HMLE-钉子、MCF7-RAS、MCF-RAS-Sox9[18——20]. U87、HT29、NCI-H596和SUM149PT细胞系来自美国型培养物收集（ATCC）。
动物伦理声明
弗雷德里克国家实验室由国际实验动物护理评估和认证协会认证，并遵循实验动物护理和使用公共卫生服务政策。所有研究均由NCI机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并根据批准的动物护理和利用委员会协议，按照“实验动物护理和应用指南”（国家研究委员会；1996年；国家科学院出版社；华盛顿特区）中概述的程序进行。
动物模型研究
小鼠被关在无菌的、带过滤罩的聚碳酸酯笼子（新泽西州阿伦顿的阿伦顿笼子）中，在隔离设施中保持12小时的光/暗循环，并随意提供消毒食品和水。在所有实验中，采用IACUC批准的方法（符合AVMA安乐死指南）处死小鼠，包括诱导和维持异氟醚麻醉，抽血或二氧化碳暴露至少10分钟，然后进行额外观察或颈椎脱位。每天监测所有动物的临床痛苦症状（例如驼背姿势、毛发粗糙、不活动、一般身体状况、体重减轻、食欲不振、自我隔离）。用湿饲料/水凝胶处理有痛苦迹象的动物TM（TM）如果体征轻微（体重减轻低于20%；只有1个临床体征明显），或者如果体征超过轻微，则实施安乐死。
兔子被关在笼子里，并通过空气交换进行光/暗循环饲养。兔子可以随意获得食物和水。所有兔子实验均按照IACUC批准的方案进行，每天监测兔子的临床痛苦症状（例如嗜睡、过度反应、运动反应、营养状况、皮毛状况、姿势、呼吸和身体功能）。在兽医的指导下，根据设施兽医计划对表现出痛苦迹象的兔子进行治疗，如果症状严重，则实施人道安乐死。
对于H596肝细胞生长因子敲除实验，雌性SCID/NCr（“SCID”）和纯合子肝细胞生长因子敲入（“肝细胞生长因子ki/ki“）SCID/NCr小鼠(高血糖原肌球蛋白1.1（HGF）Aveo Prkdc公司科学情报部/J） 来自美国杰克逊基因组医学实验室。这个肝细胞生长因子ki/ki（关/关）小鼠携带2份“人性化”敲入突变(肝细胞生长因子ki公司)取代内源性小鼠的外显子3–6血红蛋白人类第2-18外显子基因高血糖基因。通过皮下注射NCI-H596细胞植入动物，并监测肿瘤生长(n个=每组5只动物）。肿瘤重量达到300 mg后，在液氮中快速冷冻并固定在10%中性缓冲福尔马林中，处理后切片进行IFA分析。
在VS-6063实验中，将SUM149PT肿瘤植入SCID/NOD小鼠，并分期至150 mg肿瘤重量。将动物随机分组(n个=每组4人）。当肿瘤体积达到约200毫米时三给动物服用VS-6063（67.5 mg/kg PO，BID，持续21天）。在最后一次给药后4天采集肿瘤，在液氮中快速冷冻，固定在10%中性缓冲福尔马林中，并切片进行IFA分析。
电化学发光免疫分析法测定人血浆hHGF水平肝细胞生长因子ki/ki（关/关）老鼠
如前所述，使用双位点电化学发光免疫分析法测量小鼠血浆中的人类HGF蛋白含量，该方法是为中尺度探索2400平板阅读器开发的[21]. 从R&D Systems（明尼苏达州明尼阿波利斯）获得HGF捕获和检测抗体（MAB-694）和纯化重组HGF蛋白参考标准物（294-HG）。本试验的检测下限为0.75 pg/mL，96 well格式，使用25μL样品体积，总蛋白浓度为0.25 mg/mL。除非另有说明，否则所有样品均为一式三份。
靶肽或重组蛋白阻断实验的异种移植活检和肿瘤组织微阵列（TMA）
采用标准解剖方法收集全异种移植瘤。用细尖剪刀或单边手术刀将标本切成两到四等份，并在切除后一分钟内将活检芯接触试管内部，立即在液氮预冷、o型环密封、圆锥形底部、带螺钉的1.5-mL Sarstedt冷冻瓶中快速冷冻。将具有冷冻组织或细胞的管在干冰上预冷，在10%中性缓冲福尔马林（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）中固定48小时，并在使用1.0mm芯针阵列器排列之前包埋在石蜡中。
异种肿瘤标本的免疫荧光显微镜分析
将FFPE组织切成5μm的切片，放在载玻片上。使用BOND-MAX Autostainer（德国威兹拉莱卡微系统公司）进行染色。通过在100°C的柠檬酸盐（pH 6.0）中孵育10分钟来进行热诱导抗原回收。为了进行EMT多重IFA检测，使用了针对E-cadherin（克隆36，Alexa Fluor（AF）488，BD Biosciences，San Diego，CA）和vimentin（克隆V9，AF790，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX）的荧光偶联兔单克隆抗体。使用上述E-cadherin抗体以及未结合的兔单克隆抗体（蜗牛41–7、Slug 9–12、Sox9 15–4或GSC 1-5）作为一级抗体，并使用10μg/mL山羊抗兔AF 546（加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）作为二级抗体，在邻近肿瘤组织切片上进行EMT TF多重IFA。使用未结合的兔单克隆CD133 47–10抗体和市售小鼠单克隆抗CD44v6抗体（克隆2F10，R&D Systems）作为一级抗体，分别使用10μg/mL山羊抗兔AF546（Life Technologies）和抗鼠AF488作为二级抗体，进行CSC多重IFA。使用Aperio FL Scanner和Spectrum Analysis软件以及宽视野荧光和共焦显微镜（Nikon 90i Andor Camera，NIS Elements software）进行图像采集。使用Definiens软件（Tissue Studio Architect）进行图像分割和定量多重分析。
免疫组织化学或免疫荧光显微镜分析中抗体信号的靶肽或重组蛋白阻断
与GSC、Sox9和Slug抗体的目标表位相对应的合成肽（新英格兰肽、加德纳、MA）（参见S3表)分别以100倍摩尔过量量和10μg相应抗体在4°C下培养过夜。仅用缓冲液培养的抗体作为对照。用缓冲肽或封闭肽孵育的抗体对H596肿瘤TMA进行免疫组织化学分析肝细胞生长因子ki/ki（关/关）使用抗兔−HRP二级抗体的小鼠。同样，将全长重组蜗牛蛋白与蜗牛41-7抗体以10倍摩尔过量孵育，以阻断H596上的IFA染色/肝细胞生长因子ki/ki（关/关）使用抗兔−AF488二级抗体的TMA载玻片。对应于CD133结构域A（氨基酸残基295–328，分子量3856 kD）和结构域B（氨基酸615–643，分子量3403 kD）的肽将CD133 47–10抗体与20倍摩尔过量量在4°C下孵育过夜，以使用抗兔AF546二级抗体阻断HT29 FFPE细胞颗粒块的IFA染色。
使用抗CD133抗体的流式细胞术
W6B3C1、293C3和AC133抗体来自Miltenyi Biotec（德国Bergisch Gladbach）。用10 mM EDTA在PBS中从细胞培养板上收集HT29细胞。等分样品为1×106每个细胞在4℃下用无抗体（对照）或10μg/mL CD133 47-10、W6B3C1、293C3或AC133抗体染色30分钟。结合抗兔AF488或抗鼠AF488作为次级抗体。同位素控制抗体包括作为CD133 47–10对照的兔IgG同位素控制（目录号10500C，ThermoFisher Scientific）和作为W6B3C1、293C3和AC133对照的Alexa Fluor 647小鼠IgG1、κ同位素控制（目号566011，BD Biosciences）。
统计分析
EMT和CSC标记表达比较的统计意义通过使用GraphPad Prism程序的非参数Mann-Whitney检验确定（GraphPad-Software，加利福尼亚州拉荷亚）。显著性水平（α）0.05被用作界定统计显著性的分界点。
结果
单克隆抗体生产和在体外和体内特性描述
为了满足对用于定量评估EMT和CSC相关蛋白的高度特异性单克隆抗体的需求，我们产生了与几个相关靶点相对应的抗原肽或全长重组蛋白，用于兔免疫(表1和S4表). 与EMT TF相对应的免疫原肽被设计为利用保守DNA结合区远端的独特蛋白质区域；例如，在Slug的情况下，我们使用了一个与Slug特有的未知功能区（残基95-122）中的序列相对应的肽[22]. 为了产生抗CD133抗体，我们选择了与第一和第二细胞外环内以及所有已知糖基化位点远端区域相对应的抗原肽，因为糖基化已被证明会干扰几种现有CD133抗原的结合[7].
用感兴趣的肽或蛋白质免疫后，进行基于ELISA的血液筛查、脾切除术以及杂交瘤的产生和筛查（如S1图)基于ELISA和Western blot分析，我们使用重组靶蛋白或含靶表位肽，并基于癌细胞株的免疫荧光显微镜分析，选择了特异性抗体亚克隆。然后，我们通过免疫荧光显微镜、ELISA和Western blot分析对靶蛋白过度表达的细胞裂解物进行进一步表征，并通过免疫沉淀-质谱（IP-MS）检测与靶表位包含肽或重组全长蛋白质和/或蛋白质结构域结合的抗体(S4系列和第5章表）。这里提供的所有抗体都可以通过爱荷华大学的发育研究杂交瘤库获得(http://dshb.biology.uiowa.edu/)和NCI癌症抗体门户临床蛋白质组技术https://proteomics.cancer.gov:抗体-入口).
基于严格的靶向特异性选择标准和使用这些不同的检测平台的功能效用，我们能够验证GSC、Sox9、Slug、Snail和CD133的抗体(表1,表2和S4表). 通过Western blot检测抗体是否能够检测靶蛋白过度表达，并使用各种相关细胞系和异种移植模型通过免疫荧光显微镜检测靶蛋白表达和适当的细胞内定位(表1和图1——三); 在这两种检测中，在使用荧光标记的抗兔二级抗体之前，使用未标记的一级抗体。在父母和匹配的EMT蛋白过表达细胞系中检测抗-EMT TF抗体，包括SV40中非条件（GSC）或强力霉素诱导（Slug和Snail）过表达和人类端粒酶逆转录酶（hTERT）永生化人类乳腺上皮细胞（HMLEs）[19]. 同样，在转化的MCF7-RAS细胞中评估抗Sox9抗体，这些细胞有或没有Sox9过度表达[20,23]. 在U87 MG和HT29细胞中检测CD133抗体，已知这两个细胞分别表达低水平和高水平的内源性CD133[24]; 与其他肿瘤细胞系相比，HT29细胞还表达高水平的其他已知CSC标记物，如Nanog、ALDH1和pY397 FAK(S2图). 通过Western blot成功检测到抗-EMT TF抗体，与野生型细胞相比，靶蛋白过表达细胞中相应靶蛋白的表达更高，并且通过荧光显微镜分析靶蛋白过度表达细胞和肿瘤组织，得出了预期的核染色模式自然产生的MEsenchymal细胞8（NAMEC8）异种移植模型[18]（图1和2). 在抗Slug抗体的情况下，在多西环素诱导的Slug过度表达HMLE细胞和NAMEC8异种移植瘤组织中观察到细胞核和细胞质染色(图2B和2C)如之前在其他肿瘤细胞系和组织标本中所观察到的[25——28]. 抗CD133抗体在HT29细胞中成功检测到CD133，但在U87 MG细胞中检测不到，并在HT29和异种移植瘤组织中产生预期的质膜染色模式(图3A–3C).
为了确保肿瘤组织IFA分析准备中所选抗体的选择性，我们对表位和非表位肽和/或蛋白质结构域进行了IP-MS分析，并使用靶蛋白表达细胞系或异种移植或人类肿瘤组织进行了肽阻断IFA或免疫组化实验。IP-MS结果证实，抗Sox9、-Slug、-Snail和-CD133抗体选择性地与表位肽和蛋白质结合，而检测到的非表位分子没有结合(表2). 对于使用全长重组GSC作为免疫原生成的GSC抗体，GSC肽的IP-MS实验确定了表位包含序列（氨基酸残基2-18）。肽阻断显微镜实验进一步证明了每种抗体的选择性，这表明，当感兴趣的抗体和相应的细胞或组织与含有目标表位的未标记肽或蛋白质的摩尔过量孵育时，在细胞丸或异种组织标本中观察到的强免疫组织化学/免疫荧光信号被消除(图3D,S3图和S3表). 在CD133 47–10的情况下，HT29细胞颗粒和人腮腺肿瘤组织中的免疫荧光和免疫组织化学信号分别被与第一细胞外环中的表位含区相对应的肽阻断（“结构域A”；图3D和S3图); 然而，HT29细胞中的CD133 47-10免疫荧光信号没有被对应于第二胞外环（“结构域B”）的肽阻断，进一步证明了该试剂的选择性(S3图). 这些IP-MS和显微镜结果共同证实了新型EMT和CD133抗体对显微镜研究的选择性。
新型和市售抗CD133抗体在免疫荧光显微镜和流式细胞术中的应用比较
为了进一步说明我们的新型CD133 47–10抗体在评估肿瘤细胞和组织中CD133水平方面的价值，我们比较了该抗体在免疫荧光显微镜和流式细胞术应用中的性能，至3种用于临床标本分析的市售抗CD133单克隆抗体：Miltenyi Biotec克隆W6B3C1、293C3和AC133[7,29,30]. 这些抗体针对未知的表位，称为“表位1”（W6B3C1和AC133）和“表位2”（293C3；参见S2表)被认为是由于糖基化和/或蛋白质构象的变化而改变的[7——9]. CD133 47–10在免疫荧光显微镜实验中表现优于这些商业抗体，当在相同浓度下使用时，相对于后一种试剂，产生更强的荧光信号(图3C). 我们还检查了CD133 47–10对表达CD133的HT29细胞进行流式细胞术分析的适用性，再次将该抗体与商用W6B3C1、293C3和AC133抗体进行比较。虽然CD133 47–10通过流式细胞术成功区分CD133阳性细胞，但与本实验中的商业抗体相比，CD133 47-10的荧光信号强度略低(图3E); W6B3C1的荧光强度（ΔMFI）在每种抗体与其匹配的同型对照之间的中位数差异最高（7.1×10三)其次是293C3（6.9×10三)，CD133 47–10（4.4×10三)，然后是AC133（2.3×10三). 总之，这些免疫荧光显微镜和流式细胞术研究证明了CD133 47–10抗体在这两种应用中检测CD133阳性细胞的能力，其检测方式与常用的商用抗CD133抗体相当或优于后者。
新型抗体在人HGF敲除非小细胞肺癌小鼠异种移植模型中EMT特征的应用
为了说明我们的新型EMT-TF抗体在复杂组织学背景下检测肿瘤细胞EMT的价值，我们使用这些抗体来评估人类EMT TF的表达高血糖(肝细胞生长因子)植入人H596非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤的敲除小鼠异种移植模型受到EMT诱导，其原因是：1）小鼠基质细胞在肿瘤微环境中hHGF的组成性表达和分泌[11]和2）人MET受体在H596肿瘤中的增强活性遇见抑制MET蛋白酶体降解的外显子14−跳跃突变[12]. 相对于植入野生型SCID小鼠的H596非小细胞肺癌，H596肿瘤植入纯合人类高血糖敲入(肝细胞生长因子ki/ki（关/关）)小鼠的生长速度和间充质样表型增强，后者通过E-cadherin和vimentin的免疫荧光分析进行评估，E-cadherinVimentin是上皮和间充质体状态的标记[11]. 我们首先确认H596携带肿瘤肝细胞生长因子ki/ki（关/关）与H596荷瘤SCID小鼠相比，小鼠血浆hHGF水平显著升高，后者的血浆hHGF水平低于定量下限(S4图). 这种增强的血浆hHGF与E-cadherin的显著下调有关(P（P）<0.05），波形蛋白上调(P（P）<0.01），因此，增加了间充质样特征（根据对数测量10波形蛋白：E-钙粘蛋白比值；P（P）<0.01）的H596肿瘤肝细胞生长因子ki/ki（关/关）老鼠(图4).
我们的新抗体的应用表明，在SCID小鼠的H596肿瘤中，Sox9、Slug和Snail的表达相对较低，与E-cadherin的表达大致重叠，并且主要定位于呈现鹅卵石样上皮形态的肿瘤细胞(图5). 相反，H596肿瘤来自肝细胞生长因子ki/ki（关/关）小鼠普遍表现出这些EMT-TF的表达增加，尤其是在缺乏E-cadherin表达的纺锤形、形态学间充质细胞中。这些EMT TF−阳性的形态学间充质细胞在基质内或肿瘤-基质界面的小而孤立的簇中观察到(图5)正如预期的那样，小鼠基质细胞分泌的hHGF在激活肿瘤细胞EMT中的作用。使用Definiens软件对EMT TF表达进行定量显示，H596肿瘤中Snail和Slug的表达在统计学上显著增加肝细胞生长因子ki/ki（关/关）相对于SCID小鼠(P（P）<0.05和P（P）分别<0.001），而Sox9表达的轻微增加没有统计学意义(图5B、5E和5H). 此外，在来自肝细胞生长因子ki/ki（关/关）与SCID小鼠相比（数据未显示），这可能是因为GSC相对于其他EMT TF的独立调节[19]. 因此，我们针对EMT转录因子的新型抗体能够检测到H596肿瘤间质样特征的预期增加肝细胞生长因子ki/ki（关/关）与SCID小鼠进行比较，并描述与这种间质样状态相关的特定EMT TF。
应用新型抗CD133抗体评估FAK/CSC抑制剂VS-6063治疗三阴性乳腺癌异种移植模型后CSC表型的调节
为了证明我们的新型抗CD133抗体在评估肿瘤CSC表型调节方面的实用性，我们将CD133 47–10应用于FAK抑制剂VS-6063（defactinib；原名PF-04554878）治疗的异种移植模型的肿瘤组织切片，在TNBC异种移植模型中，其优先靶向CSC并已被证明可减少转移性生长[13]. 在本实验中，我们选择了SUM149PT TNBC异种移植模型，因为已知相应的细胞系包含分化细胞和CSC样未分化细胞群体[31]. 将携带SUM149PT肿瘤的小鼠用载体或67.5 mg/kg VS-6063每天两次治疗21天，并在最后一次给药后4天采集肿瘤，用Definiens软件进行切片免疫荧光显微镜和定量分析(图6). 正如预期的那样，我们观察到VS-6063−治疗组的平均CD133阳性肿瘤细胞面积明显小于载体组（2.1μm VS.46.6μm2/细胞；P（P）<0.05) (图6C). 为了进一步探讨这种药物引起的CSC特征的变化，我们使用了一种商用抗体来评估CD44v6的水平，这是一种CSC相关的CD44亚型，可促进肿瘤细胞运动，并与乳腺癌患者预后不良相关[32——34]. 与溶媒组相比，VS-6063治疗的肿瘤的CD44v6阳性肿瘤细胞面积稍低（但不显著）(图6A和6C)这表明我们的新型抗CD133抗体可以更灵敏地检测SUM149PT模型中的CSC调制。
讨论
我们已经证明了几种抗体的亲和力、选择性和临床前适用性，用于检测和定量与上皮-间充质转化和癌细胞干细胞相关的蛋白质。我们对每一种抗体的表位序列进行了表征，这使得这些试剂在识别蛋白质表达的真正差异方面特别有用，而与靶表位未知或专有的几种针对EMT和CSC因子的现有抗体相比。例如，在广泛使用的针对未知表位AC133和AC141的CD133抗体（均被认为位于第二个细胞外环）的情况下，表位识别依赖于特定的糖基化模式和/或蛋白质构象导致了错误的结果[7——9]. 因为我们的新型抗CD133抗体CD133 47-10设计用于靶向糖基化位点远端的表位，所以该抗体可以提高CD133检测的准确性。虽然并非所有的抗体靶点都会被这种严重的表位掩盖问题所混淆，但对所有新抗体的表位进行识别，可能会使针对未知或未公开表位的许多现有商业抗体的蛋白质表达分析更加精确。例如，我们发现CD133 47–10通过IFA产生的荧光信号比针对AC133和AC141的其他商用抗体更强。
我们将EMT TF抗体应用于人HGF敲除模型的异种移植物实验，说明了在表征肿瘤EMT表型时检查多种EMT相关因素的重要性。H596中肿瘤波形蛋白和E-钙粘蛋白的定量-肝细胞生长因子ki/ki（关/关）该模型首次明确证明了EMT在这些肿瘤中的存在，我们的发现与之前的结果一致体内小细胞肺癌异种移植物模型的研究表明HGF/Met通路激活和间充质标志物表达增加与致瘤和化疗耐药肿瘤表型之间的相关性[35]. H596中波形蛋白和E-钙粘蛋白的定量-肝细胞生长因子ki/ki（关/关）该模型还验证了该模型在EMT-TF表达评估和其他EMT未来研究中的应用；我们发现，该模型中的组成诱导EMT能够检测到EMT-TFs，而EMT-TF通常仅在药物诱导EMT期间短暂表达。有趣的是，尽管该模型中存在构成性EMT，但波形蛋白、Slug、蜗牛和Sox9的表达增强（尽管在后一种情况下并不显著）证明了这一点，GSC在H596肿瘤中的表达没有增加肝细胞生长因子ki/ki（关/关）与SCID小鼠进行比较。已观察到GSC监管与其他EMT TF的监管不同[19]，我们的数据强调了在单个组织样本中检测多种EMT相关因子的价值，以充分表征过渡或任何稳定的混合EMT状态的动力学。
同样，在未来通过免疫荧光显微镜和流式细胞术检测CSC表型的研究中，我们开发的区域特异性抗CD133抗体将被证明对该标记物的无歧义检测有用。与EMT研究一样，CSC表征的复杂性保证了对多个CSC相关因素的评估。我们关于VS-6063−治疗的SUM149 PT异种移植物的数据说明了这一点；虽然我们的CD133 47–10抗体在使用这种FAK抑制剂治疗后显示CD133显著降低，但使用抗CD44v6的商业抗体只显示了这种CSC因子的小幅度、无显著性治疗诱导的降低。尽管一般来说，CSC标记物反应之间的差异可能是由于不同肿瘤类型中各种CSC标记的表达差异及其与预后的关系[36]，先前的研究已经确定CD44v6是MDA-MB-468 TNBC乳腺癌细胞系中的一种细胞运动诱导因子[34]乳腺癌患者的预后因素[32,33]. 我们的数据表明，对于SUM149PT模型，与检测CD44v6相比，使用我们的新抗体检测CD133可能是CSC对VS-6063反应的更敏感标记。
随着这些特征与转移和耐药性相关的证据不断积累，监测肿瘤EMT和干细胞的临床重要性日益明确[4,37]. 因此，有必要进行额外的临床前工作，以探索这些疾病结果背后的分子过程，而这里介绍的抗体将有助于这些努力。特别是，因为具有“混合”或“部分”EMT表型的肿瘤细胞可能是某些癌症耐药和转移的真正驱动因素[1——4]，并给出不同组织学背景下EMT和CSC蛋白表达模式的时间和空间异质性[三,38——43]为了全面了解耐药和转移性肿瘤表型的分子基础，可能需要检查每个组织样本中的多种EMT和CSC因子。我们的新型抗EMT TF和抗CSC抗体非常适合于肿瘤组织的IFA分析，同时使用这些抗体中的几个进行多重分析，可以仔细分析临床前标本中每个靶蛋白的作用。
支持信息
S2图。跨选择的CSC标记表达式在体外细胞系。
用特定于所示CSC相关蛋白的一级抗体（顶部）培养细胞株（左侧），然后培养相应的荧光共轭二级抗体，以表征每个细胞株中CSC标记的表达（绿色，CD44v6；红色，Nanog；金色，ALDH1；绿色，pY397-FAK；蓝色，DAPI；显示代表性的20X图像）HT29因其高CD133表达而被选用于检测CD133抗体，也表现出其他CSC标记物（Nanog、ALDH1和pY397-FAK）的高表达。用于该实验的初级抗体包括小鼠单克隆抗CD44v6（克隆2F10，R&D Systems，Minneapolis，MN）、兔单克隆抗ALDH1（克隆EP1933Y，Abcam，Burlingame，CA）、山羊多克隆抗Nanog（目录号AF1997，R&D Systems）、，和兔抗磷酸化单克隆Tyr397-FAK（克隆D20B1，细胞信号技术，丹弗斯，马萨诸塞州）。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199361.s002
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S3图。阻断实验证明了所选新抗体对EMT转录因子和CSC因子的免疫荧光显微镜或免疫组织化学检测的特异性。
纯合子肿瘤组织肝细胞生长因子植入H596 NSCLC肿瘤（A-D）或HT29细胞颗粒（E）的敲除小鼠与GSC（A）、Sox9（B）、Slug（C）、Snail（D）或CD133结构域A（E）抗体结合。此外，将组织/细胞颗粒和抗体与缓冲液/BSA（左）或与每种抗体（右）的目标表位相对应的肽/蛋白质以相对于抗体的指示浓度孵育（参见S3表用于阻断肽/蛋白质序列）。靶蛋白用HRP-结合抗兔抗体（A-C）免疫组化或用荧光结合抗兔二级抗体（D-E）免疫荧光显微镜观察；显示了具有代表性的20X图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199361.s003
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S4图。纯合子人血浆HGF水平升高肝细胞生长因子敲入小鼠。
SCID或纯合子肝细胞生长因子敲入(肝细胞生长因子ki/ki（关/关）)小鼠植入H596非小细胞肺癌肿瘤(n个＝每组5只动物），并且在植入后33天收获肿瘤。（A） 纯合子肝细胞生长因子敲除增强H596荷瘤SCID小鼠血浆hHGF水平。SCID动物的血浆hHGF水平低于定量下限（LLQ）0.00075 ng/mL（红色虚线）；平均血浆hHGF±标准偏差肝细胞生长因子ki/ki（关/关）动物展示(n个= 5).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199361.s004
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致谢
作者希望感谢Robert Weinberg在抗体靶点选择方面的指导，感谢Elinor Ng Eaton在通过Western blot和IFA鉴定抗体特性方面的卓越协助。我们还感谢布拉德·古克、林赛·杜特科和唐娜·布彻对组织技术专家的支持；技术实验室支持Anne Book；Karun Mutreja和Scott Lawrence提供显微镜支持；Facundo Cutuli和King Leung Fung提供流式细胞术支持；以及Leidos Biomedical Research，Inc.的Andrea Regier Voth博士和Kelly Government Services的Sarah Miller博士，为本手稿的编写提供书面支持。
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