2.1. 样品制备

葡萄糖异构酶GI（木糖异构酶）是作为晶体悬浮液从汉普顿研究所购买的，而牛血清白蛋白（BSA）、马心脏细胞色素C和牛胰腺核糖核酸酶a（RNAse）的粉末形式是从西格玛购买的。鸡肉蛋清溶菌酶也呈粉末状，来源于USB公司。这些蛋白质都是SAXS标准的特征（马修等。, 2004; Mylonas&Svergun，2007年). 蛋白质在277 K温度下溶解并在以下缓冲液中透析过夜：GI，200 mM（M）氯化钠，1米M（M）氯化镁₂，10米M（M）MES，pH 7.0；BSA，50米M（M）HEPES，pH值7.5；细胞色素C和RNA酶，磷酸盐缓冲液，pH 7.0；和溶菌酶，150米M（M）氯化钠，40米M（M）乙酸钠，pH 3.8。使用280 nm处的适当消光系数确定最终样品浓度，表示为E类_0.1%（毫克毫升⁻¹)，根据一级氨基酸序列计算（ProtParam；Gasteiger等。, 2005)除了细胞色素C，其浓度是根据组成样品的干重估算的。Abs公司_280纳米 E类_0.1%每种样品的GI为1.074 mg ml⁻¹; 牛血清白蛋白，0.614毫克毫升⁻¹; RNA酶，0.653毫克毫升⁻¹; 溶菌酶，2.653毫克毫升⁻¹结果中报告了使用的最终浓度。测试了三种溶液添加剂（二硫苏糖醇（DTT）、抗坏血酸和甘油）在限制X射线照射期间辐射损伤方面的效果。这些添加剂在各自的透析后缓冲液（DTT，10 mM（M）; 抗坏血酸盐，10米M（M）; 甘油，50%v（v）/v（v）)并相应调整pH值，以防止在稀释到蛋白质样品中时出现pH值休克。用于辐射损伤实验的每种添加剂的最终浓度为1mM（M）DTT，1米M（M）抗坏血酸和5%v（v）/v（v）甘油。

2.2. SAXS数据收集

SAXS强度数据[我(q个)与 q个，其中q个= 4π罪θ/λ, 2θ是散射角]光子通量第5.1×10页¹² 光子s⁻¹10千伏(λ=0.124 nm），使用最大尺寸为500（H）µm×250（V）µm[200（H）¦Μm×110（V）¦µm，FWHM]的三对狭缝准直入射光束。样品置于1.8 mm石英毛细管（内径1.7 mm）中，在283 K下保持真空。[与Kuwamoto达成一致等。(2004)，较高的样品温度（283–313 K）仅对X射线引起的辐射损伤的初始速率产生轻微影响(即聚合）；数据未显示]。使用DECTRIS PILATUS 2M光子计数探测器收集数据，帧速率为30 Hz，读取时间为2.2 ms。采用非标准批量模式的样品交付和收集方案。连续流自动样品输送被禁用，取而代之的是带有静态样品数据收集的手动加载（10µl）。使用不同的曝光时间（50 ms至1.41 s），在20–100个连续数据帧内，采集有或无不同程度光束衰减的溶菌酶数据。光束衰减到7.3×10¹¹ 光子s⁻¹（中等衰减）或1.8×10¹¹ 光子s⁻¹（高衰减）是通过将300µm或480µm厚的铝箔移动到入射光路径中来实现的。使用全未衰减光束对GI、BSA、细胞色素C、RNA酶和溶菌酶进行溶液添加剂实验（DTT、抗坏血酸和甘油）。结果中报告了准确曝光时间和衰减系数的详细信息。

2.3. SAXS数据分析

使用基于以下公式的吉尼亚近似值评估辐射损伤对每个蛋白质样品影响的定性测量我(q个)=我（0）经验(-R（右）_克 ²q个²/3)，其中R（右）_克是回转半径和我（0）总数前向散射以零角度记录（吉尼尔，1939). 在典型情况下(例如。对于溶液中的球状蛋白质）ln的线性外推[我(q个)]与 q个²低角度计算qR（质量风险）_克<1.3应提供我（0）在q个=0截距和与R（右）_克粒子的。本研究中研究的每种蛋白质都遵循单分散样品的吉尼亚近似值R（右）_克已知每种蛋白质在未受损状态下的值（Mylonas&Svergun，2007; 格拉切法等。, 2013; 马修等。, 2004). 因此R（右）_克来自未损坏样本的值可以用作监测辐射暴露影响的参考框架，即使吉尼亚阴谋由于聚集而分解。敏感性R（右）_克溶液中颗粒的形状和尺寸（R（右）_克球状蛋白代表显著的质量再分配）R（右）_克一种简单方便的探针，用于量化损伤。因此，ln的强制线性回归[我(q个)]与 q个²穿过一个固定的qR（质量风险）_克0.8对应的范围<q个R（右）_克^u个<1.3被用作辐射损伤的经验测量，其中R（右）_克^u个是回转半径未受损的蛋白质。数据线性拟合斜率用于计算伪-R（右）_克值(R（右）_克^秒)对于损坏的样品。必须强调的是，伪-R（右）_克使用此方法的值与实际值不符R（右）_克但仅用于表征骨料的累积，特别是我们定义为的“初始损伤率” 秒⁻¹从每个数据集的前五帧开始计算，并归一化为单位时间。使用简化的χ²在的DATCMP工具中实现的测试ATSAS公司包装（Petoukhov等。, 2007, 2012). 显著性水平设置为0.01，即比较帧时，第页>0.01表示相似性。

2.4. 临界剂量的计算

临界剂量，D类，单位为Gy或每千克能量（J kg⁻¹)需要更改R（右）_克^秒相对于初始数据帧的最大值为0.1 nm，使用从Meisburger导出的关系进行计算等。（2013年)考虑到样品的有限路径长度：

哪里E类是每光子的能量（单位：J光子⁻¹). 价值观t吨，临界剂量时间（s），直接从R（右）_克^秒 与时间（参见支持信息的图S1¹)或根据初始利率估计值计算的外推时间( 秒⁻¹). 在这里，（f）表示梁通量（光子s⁻¹)考虑到毛细管第一个50µm石英壁的透射（假设质量密度石英2.648 g cm⁻³). 使用X射线光学中心服务器计算石英传输(https://henke.lbl.gov/optical_constants/filter2.html; 亨克等。, 1993). 这个质量密度样品的ρ_米（克厘米⁻³)，使用计算得出护根物（惠顿等。, 2008)，同时A类（厘米²)是总光束面积L（左）（cm）样品厚度（对应0.17 cm的毛细管内径）。平均值质量衰减系数，μ/ρ（厘米² 克⁻¹)在没有相干散射的情况下，使用XCOM光子截面数据库根据总原子组成计算每个样品的(https://www.nist.gov/pml/data/xc/index.cfm网址; 伯杰等。, 2010). 使用ProtParam（Gasteiger）计算每个蛋白质的原子公式等。, 2005). 系数1000转换J g⁻¹单位：Jkg⁻¹以获得Gy。请注意，上述关系计算了在最大束流尺寸（0.00125 cm）范围内传递到样品的平均剂量²),即它假设通过总光束面积的平均均匀照明，而不是计算光束强度峰值（0.00022cm）的剂量²FWHM）。更多信息，包括μ/ρ值，请参考支持信息的表S1–S4。

3.1. 流动启用与静态样本数据采集

图1(一)显示从溶菌酶样品（4 mg ml）测量的SAXS数据⁻¹; 5×50 ms帧），使用P12波束线的默认用户采集方案，即启用采样流（30µl s⁻¹)在全光束强度（5.1×10¹² 光子s⁻¹，10千伏）。数据绘制在对数刻度上，以强调低-秒由损伤引起的任何影响在散射强度中变得明显的散射数据区域。在这种情况下，五个数据帧重叠和散射剖面在低电平时显示为“平坦”-q个这表明辐射损伤可以忽略不计。当比较数据帧时，在250 ms曝光后，可以在非常低的角度识别细微的辐射损伤（帧1与第5帧，第页=0.006）。因此，即使启用了样品流，样品仍可能发生辐射损伤。然而R（右）_克^秒溶菌酶( 秒⁻¹)如图1所示(c)（～0–0.1纳米秒⁻¹)与使用静态样本数据收集策略相比，支持样本流显著减少损坏的情况（图1b条). 当样品流停止时，随着连续数据帧中时间的增加，可以观察到低角度散射强度的系统性增加。首字母 秒⁻¹增加到5.5 nm s⁻¹[图1(c)，黑色钻石]，暴露50 ms后，样品受损。对于本研究剩余部分报告的结果，收集了失能流的数据，即使用非标准数据采集协议。这种选择是经过深思熟虑的：首先，它有助于将受控辐射输送到相同体积的样本中，以进行后续的比较分析；其次，它产生了比用户样本通常经历的更极端的辐射环境。

图1 样品流量对溶菌酶样品辐射损伤的影响。(一)使用默认的P12光束线用户采集策略采集的五个溶菌酶SAXS数据帧，在全光束强度（5.1×10）下启用采样流12 光子s−1，10千伏）。(b条)在样品流停止的情况下，记录溶菌酶的SAXS数据。(c)伪-R（右）克参数(R（右）克秒)用于限定初始辐射损伤率与暴露时间，比较在“无流动”（黑钻石）或样品流动条件下（开放圆圈）采集的溶菌酶样品。

3.2. 光束衰减

P12光束线的光束衰减很简单，只需在GUI上单击一个按钮即可完成，该GUI允许将不同厚度（300和480µm）的铝箔移动到入射光束中。图2(一)–2(c)显示了光束衰减对从4.4 mg ml溶菌酶采集的SAXS数据的影响⁻¹5×50 ms曝光。完全光子通量(5.1 × 10¹² 光子s⁻¹)样品损坏明显（第1帧与框架2，第页=0），当通量减少到7.3×10¹¹ 光子s⁻¹（第1帧与框架5，第页=0.4）和1.8×10¹¹ 光子s⁻¹（第1帧与框架5，第页=0.09），如图2所示(d日).临界吸收剂量，单位为kGy（J kg⁻¹)溶菌酶或溶菌酶相对于初始数据帧0.1 nm的变化在衰减系列的0.28–0.35 kGy范围内。这些数值与Kuwamoto报告的0.4 kGy的数值相似等。(2004)对于溶菌酶，使用相同的缓冲液，在类似的蛋白质浓度下，这两种方法都通过监测回转半径以及骨料的形成。对于无衰减、中等衰减和高衰减，骨料形成所需的时间分别为0.018、0.135和0.45 s。这些时间比Kuwamoto在~2.1s时更短，反映了能量的差异（13.8keV），通量(2.2 × 10¹¹ 光子s⁻¹)重要的是，用于实验的更大的束流面积[800（H）µm×600（V）µm]。因此，需要谨慎解释此处报告的临界剂量值（见表S4）：在实际水平上，重要的不是剂量的绝对值，而是在临界剂量时间之前可以从未受损样本中采集的SAXS数据帧的数量，以及可以采取什么措施来增加安全采集时间通过光束衰减或通过修改溶剂条件（见下文）。更复杂的是，临界剂量可能会随着溶剂条件（盐、pH、，等)，这可能（也可能不会）导致蛋白质平衡向易于化学或辐射诱导聚集的状态转变。

图2 光束衰减的影响。静态4.4 mg ml记录的SAXS数据（5×50 ms暴露）−1溶菌酶样品采集地点：(一) 5.1 × 1012 光子s−1, (b条) 7.3 × 1011 光子s−1, (c) 1.8 × 1011 光子s−1。每个图上都报告了溶菌酶样品在每个衰减水平下的临界剂量（kGy）。(d日)将初始损伤率（黑钻石）与全光束下的初始损伤率进行比较通量启用采样流（白色圆圈）。通过调整每个衰减水平（无衰减、中等衰减和高衰减分别为50 ms、0.32 s和1.41 s）下的暴露时间，从每帧暴露于大致相同剂量的静态样品中估算初始速率。

波束衰减的主要优点是无需改变样品条件以减少辐射损伤的影响。然而，必须从散射信号强度受损和数据质量总体下降的角度评估衰减的好处。从图2(c)可以看出，随着光束的衰减，散射信号中的噪声增加。因此，衰减入射光束的选择必须从数据质量的角度进行评估与样品数量和SAXS实验类型。对于标准批处理模式分析，可能需要从高灵敏度样品的若干等分样品中收集数据，同时启用光束衰减和样品流，以便获得足够的帧，以产生具有合理计数统计的平均SAXS剖面。

对于连续流动SEC-SAXS实验，当每个组分流过X射线束时，衰减可以防止聚集体在SAXS毛细管上缓慢积聚。与分批式SAXS不同的是，在连续运行之间清洗样品池，当不同的样品成分从分离柱中洗脱时，没有机会清洗SAXS毛细管，并且经常会观察到毛细管污染。因此，衰减可以减少骨料的堆积。另一方面，数据帧数量的增加（从SEC柱中洗脱的每个组分测量的25–100 1s帧）及其随后的平均值可以补偿通量减少导致的散射强度降低。

3.3. 溶液添加剂

支持信息的图S2显示了改变几种不同蛋白质样品（BSA、GI、细胞色素C、溶菌酶和RNA酶）的蛋白质浓度对其初始聚集率的影响。添加DTT、抗坏血酸和甘油以评估其减少辐射损伤的能力（Kuwamoto等。, 2004; 斯科等。2014年; 格里沙耶夫，2012年; Jacques&Trewella，2010年)在这些样品中使用全X射线束，没有样品流。10 mg ml RNA酶散射曲线示例⁻¹无添加剂和有添加剂的情况如图3所示所有三种添加剂都会减少骨料的产量，减少5%v（v）/v（v）甘油对抑制辐射损伤特别有效( 秒⁻¹≃0.2纳米秒⁻¹). 图3显示的RNAse数据(d日)（5×30 ms帧）等效(第页>0.35），在总照射300ms后首次检测到样品中的辐射损伤。GI、BSA、细胞色素C、溶菌酶和RNA酶的辐射敏感性比较表明，根据蛋白质样品的不同，初始损伤率有很大差异（图4一). 一般情况下，1 mM（M）DTT，1米M（M）抗坏血酸和5%v（v）/v（v）甘油都有助于降低不同蛋白质样品的初始辐射损伤率，尽管它们在最初具有高辐射敏感性的样品中的影响更为明显(例如。溶菌酶和RNAse）。

图3 溶液添加剂对限制辐射损伤的影响：RNA酶案例研究。(一)RNAse SAXS数据（7×30ms暴露；10毫克毫升−1)全额收款通量在没有样品流的情况下，暴露30ms后显示出严重的辐射损伤。增加1mM（M）DTT公司(b条)，1米M（M）抗坏血酸盐(c)和5%v（v）/v（v）甘油(d日)显著降低样品的辐射损伤。在甘油的情况下，直到暴露于全光束300ms之后才检测到损伤。每种条件下RNAse的临界剂量（kGy）在每个图上报告。

图4 不同蛋白质的辐射敏感性和溶液添加剂的影响。(一)GI（10 mg ml）在5×30 ms照射范围内计算的初始辐射损伤率的直方图比较−1)，BSA（11毫克毫升−1)，细胞色素C（细胞，10 mg ml−1)，溶菌酶（Lyso，8.8 mg ml−1)和RNA酶（10 mg ml−1)存在和不存在溶液添加剂（抗坏血酸、抗坏血酸钠、1 mM（M）; DTT，二硫苏糖醇，1 mM（M）; 甘油，5%v（v）/v（v）; GI/甘油和细胞/甘油测量不包括在内）。报告了临界剂量（kGy）的估计值（有关更多详细信息，请参阅支持信息的表S4）。(b条)5%的影响v（v）/v（v）由于降低了X射线对比度，溶液中BSA的溶剂校正SAXS散射强度上的甘油。

用溶液添加剂掺杂样品的优点是，用户在“光束线”处将这些成分添加到样品中相对简单。然而，对于分批模式的样品交付，在向样品和相应的溶剂空白中添加准确且相等的添加剂时必须小心，以确保不会发生溶剂错配（Jacques&Trewella，2010). 如果时间有限，可以使用校准良好的移液管或微量天平添加等量或等量的浓缩添加剂储备溶液，尽管在处理粘性甘油溶液时必须格外小心。如果使用者有额外的时间，并且没有样本限制，透析是可取的。对于SEC-SAXS，当在流动相中使用甘油时，必须考虑实验柱上的压力限制。用于SEC-SAXS实验的P12中使用的基于sepharose的分析柱可以承受5%v（v）/v（v）甘油不会破坏柱基质。

溶液添加剂方法的主要缺点是样品的化学环境会发生变化，这增加了改变蛋白质化学或物理性质的风险。例如，向以其他方式保持氧化状态的蛋白质中添加DTT可能会减少二硫键，从而导致结构上的不良变化。DTT也会经历氧化，从而改变其紫外线（280 nm）吸收特性，这可能会影响蛋白质浓度估计值（Grishaev，2012）; Jacques&Trewella，2010年). 另一方面，甘油改变了样品的对比度。甘油的加入减少了蛋白质和溶剂之间散射长度或电子密度的差异，从而降低了最终散射剖面中的散射强度。例如，在图4中(b条)11 mg ml时BSA的最终散射曲线⁻¹有或没有5%v（v）/v（v）溶液中的甘油说明我(q个)跨越所有q个由于添加了甘油。因此，尽管添加了甘油（或其他类型的多元醇，例如。蔗糖）可能有效对抗辐射损伤（Kuwamoto等。, 2004)这些电子致密材料如果过量添加到样品中，可能会降低信号强度，或者可能影响蛋白质-溶剂/蛋白质-蛋白质的相互作用（Vagenende等。, 2009)可能改变低聚物状态。根据此处提供的数据，最多可选择5%v（v）/v（v）甘油似乎是维持合理对比度和显著降低辐射损伤影响之间的平衡折衷。还必须注意，根据样品的灵敏度，可能需要进行添加剂浓度筛选，因此需要增加样品体积。Grishaev（2012）提出的限制辐射损伤的替代小分子)包括三（2-羧乙基）膦（TCEP；一种更稳定的还原剂）、乙二醇和使用三或HEPES缓冲液。