1.简介

现代显微镜发展中最紧迫的问题是将超高分辨率与所有三维成像的可能性结合起来，因为被研究样品的三维（3D）纳米结构对其生物、化学和物理特性具有基本影响。在过去几年中，可见光领域取得了显著进展（Hell&Wichmann，1994; Dyba&Hell，2002年; Rittweger公司等人。, 2009)和X射线显微镜（Dierolf等人。, 2010; 赵等人。, 2012; 施耐德等人。, 2012; 施罗普等人。, 2012; 霍勒等人。, 2014)将空间分辨率提高到了10nm。由于可用光学的限制，迄今为止X射线显微镜尚未达到衍射极限。特别是，软X射线显微镜提供了在水窗内进行共振成像的可能性，从而在中等辐射剂量下为各种软物质样品提供了优越的化学选择性对比度，而无需染色（Ade&Hitchcock，2008).

软X射线层析成像达到了36 nm的全3D分辨率（施耐德等人。, 2010)在几种相干技术中，共振傅里叶变换全息术（FTH）以横向分辨率使用同步辐射报道的16纳米（Zhu等人。, 2010). 最近用自由电子激光照明点进行的全息研究已经接近一个新的基准（Wang等人。, 2012). 另一方面，这些技术存在根本性的缺陷。层析成像中样本旋转的必要性通常会导致更复杂的设置以及相对较高的采样时间（Haddad等人。, 1994; 施罗德等人。, 2010; 施耐德等人。, 2012)因此，由于辐射损伤，样品退化的危险增加。相干技术特别容易出现照明和设置不稳定性（Schropp等人。, 2012)以及光学像差（Chabior等人。, 2012).

最近的研究表明，配备高分辨率菲涅耳波带片的标准扫描透射软X射线显微光谱仪（STXM）可以提供横向分辨率低于20 nm、沿光轴（Späth等人。, 2014一). 通过基于焦点测量的算法，可以在适当的计算时间从这些堆栈中轻松生成3D重建。该技术的关键部件是现代波带片，其最外层的超小波带宽度提供了横向分辨率在软X射线范围内约为10 nm，焦距（DOF）约为500 nm（杰菲莫夫斯等人。, 2007; 维拉·科马马拉等人。, 2009). 这种方法直观地指出了共焦STXM（cSTXM）的发展，它使用检测路径中的第二个高分辨率波带片和其后焦平面中的焦点过滤针孔。真正的共焦设置可以大大提高3D分辨率，远远超出所用光学器件的限制，并通过背景抑制提高成像质量（Sheppard&Choudhury，1977）; 布拉肯霍夫等人。, 1979). 目前共聚焦X射线显微镜通常使用毛细管光学（Janssens等人。, 1996; 坎吉斯尔等人。, 2003). 这些共焦显微镜X射线荧光设备已成功用于材料科学和环境研究，但目前提供的3D分辨率仅限于数微米（Nakano等人。, 2011; Fittschen&Falkenberg，2011年; 坎吉斯尔等人。, 2012). 硬X射线区共焦全场TXM的结果显示，在微米区具有分辨率，但到目前为止，受到非常大的照明时间和检测极限的限制（Takeuchi等人。, 2009, 2010). 然而，cSTXM提供了横向分辨率根据分区板技术（Jefimovs等人。, 2007; 维拉·科马马拉等人。, 2009). 与相应的共焦激光扫描显微镜（CLSM）类似（Dixon等人。, 1991)由于点扩散函数的模糊，轴向分辨率预计会降低约两倍（Nasse&Woehl，2010). 未来的分辨率限制将取决于波带片开发的进展，并可能在未来几年内达到数纳米。

在本文中，我们将基于两种可能的设置和cSTXM的详细对准程序，提出一项概念验证研究，该对准程序是通过将探测波带板和聚焦滤波针孔实现到标准PolLux-STXM（Raabe等人。, 2008)在瑞士光源。根据现有共焦激光显微镜设置（Pawley，2006)我们研究了同轴传输和离轴荧光检测装置。我们将首次展示cSTXM在软X射线范围内运行的实验结果，并讨论有关以下设置的局限性光子通量和检测效率。根据我们的结果，我们将总结出进一步开发这项有前途的技术的策略。

2.设置和校准程序

标准的STXM装置使用高亮度同步辐射光，通过菲涅耳波带片聚焦于样品，由于可调谐光子能量，允许高分辨率光谱对比度（Kirz&Rarback，1985; 阿德等人。, 1992). 使用干涉控制（位置稳定性：<3 nm）通过焦点对样品进行光栅扫描自由度在所有三个维度中，当使用连接到光电倍增管（PMT）或光电二极管（Kilcoyne等人。, 2003; 拉贝等人。, 2008). 使用快速读出的CCD相机（Raabe）可以记录二维图像等人。, 2009). 由于波带片产生不同的衍射级，因此使用靠近样品的排序孔径（OSA）来过滤所需的一级照明锥。在我们的第一个实验中，我们使用了最外层区域宽度的波带片第页_N个25 nm，在所研究的光子能量范围内提供约1400-1500 nm的一阶自由度（作为波长应用λ（单位：纳米），根据（阿特伍德，1999)

这些波带片尚未提供最佳的轴向分辨率，但光子速率高于15或12.5 nm波带片，因此更适合于实验装置的基本测试。

cSTXM的概念是从传统的CLSM（Dixon等人。, 1991). 然而，由于特殊限制，无法实现反射几何（180°），因此需要第二个光学元件[在我们的情况下是菲涅耳波带片（FZP）]。我们从图1所示的串联cSTXM布置开始研究因此，我们必须使用第二个波带片（ZP2）和样品与检测器之间的针孔来扩展标准STXM设置，并使其在光轴上完美居中。ZP2安装在三轴SmarACT平台上，确保高精度定位，精度优于20 nm。这个z（z）-共焦装置的分辨率受到检测针孔尺寸的强烈影响。采用薄透镜方程，样品到第二区板的距离为几厘米，可以避免对小于100 nm的针孔的需要（Sheppard&Choudhury，1977; Wilson和Carlini，1987年). 由于针孔的存在，检测路径中不需要OSA。在对准过程中，使用CCD摄像机（Andor DV860）记录信号。针孔（测试装置的直径为5µm）直接粘在相机闪烁体的前面，以实现非常高的位置稳定性。探测区域足够大，可以将探测器移动到针孔支架不再遮挡光子束的位置。

图1 传输几何中的cSTXM方案。顶部的箭头显示了各个扫描台的自由度（针孔和检测器相连）。光学元件的距离与比例不符。

图2(一)显示了这种情况的CCD图像，没有第二个波带片。检测到的信号是照明波带板的投影，在代表中央止动块的暗盘周围形成亮环。波带板的校准是在光束路径中没有样品的情况下进行的。在图像的右下角，针孔底座以黑色阴影可见。安装第二个波带板时，应通过肉眼粗略估计其正确位置。将其移动到估计位置后，我们使用x个-和年-该波带板的扫描仪根据照明光学将其对齐。当亮环完全可见且均匀时，对齐是完美的，而在暗盘的中心可以看到亮点。请注意，亮环现在弱得多，代表来自第二波带片的剩余零级光，即非焦点部分。一级衍射光聚焦在亮点上，该亮点通常在开始时更像一个小圆环。通过扫描z（z）-第二波带片的位置我们优化了焦距，并尽量使光斑小而明亮。此步骤的最终情况如图2所示(b条).

图2 对准过程中的CCD摄像机记录。(一)标准STXM设置，无第二区域板。第一个波带板生成一个照明锥，该照明锥在样品后面发散，并且由于中心挡板而中空。右下角的阴影是由固定在CCD相机前面的针孔支架造成的。(b条)cSTXM，第二个波带片在焦点上。照明锥在光轴上聚焦。亮环是来自第二波带板的残余零光（检测路径中没有OSA）。

在安装过程中，还大致定位了针孔位置。通过扫描探测器进行校准x个-和年-阶段。在对准程序结束时，必须优化第二波带片的焦点。因此，我们扫描了x个-和年-根据z（z）-并选择我们获得最亮信号的位置。为了找到并聚焦要求的样品位置，应将第二个波带板移出直射光束。干涉控制确保再次移动后保持对准。通过调整样品的z（z）-定位而不移动第一个波带片。否则共焦对准将丢失。我们还将CCD摄像头替换为PMT，以便在扫描期间以计数模式记录信号。两个探测器可以同时安装，并且可以通过将载物台移动到各自的位置来进行探测器之间的切换。

为了进一步研究，我们将设置修改为离轴几何检测荧光(囊性纤维变性.图3). 由于荧光不定向，可以根据设置要求选择检测角度（5°≤θ≤ 170°),即对于非透明样品，也可以使用反射几何图形。在目前的研究中，我们将ZP2和探测器稍微向上移动(θ≃6°），以错过直接传输的光子束。理想情况下，检测装置也应如图3所示旋转然而，对于非常小的角度，只要我们不探索最终分辨率，就可以忽略由此产生的偏差。第一次测试是在没有针孔的情况下进行的，目的是在达到分辨率极限之前检查基本的荧光成像。信号是用雪崩光电二极管，因为这些探测器提供单光子灵敏度（Dautet等人。, 1993). 在未来的研究中，还可以考虑通过并行使用多个检测器来检测传输的信号。开始时的对准程序与内嵌设置的对准程序相同。然后将ZP2向上移动260µm。应用毕达哥拉斯定理校正了检测器的位置，必须根据检测到的计数率进行调整。设置也显示在图3中的小照片插页中。此图像中显示的光学组件的距离不适合共焦成像，但已进行调整以获得更好的概览。

图3 荧光几何学中的cSTXM方案，包括PolLux室内部设置的照片（样品远离焦点，以便更好地观察）。可以根据设置要求选择检测路径的偏移角度。在本研究中，检测设备只是稍微向上移动，以错过直接光束。

3.结果和讨论

图4显示了首次报告的cSTXM装置在线几何结构的显微照片所研究的样品为AgTCNQ纳米晶，该纳米晶是在100 nm厚的标准硅上从乙腈溶液中湿法生长而成_三N个₄膜（英国Silson有限公司）（Rösner等人。, 2013). 显微照片显示，残留TCNQ的大菱形晶体上有一排小晶体。TCNQ晶体在710 eV的照明能量下几乎不可见，因为它的含量很低-z（z）元素，因此看起来几乎是透明的。另一方面，C中的能量更低K（K）-由于低焦距和当前设置中产生的几何冲突，边缘区域不可能实现。在显微照片的左下角，发现一个较大的AgTCNQ直接位于膜上。由于这种有利条件，这两种晶体类型不在垂直于光轴的同一平面上，应显示焦点偏差。cSTXM显微照片证实了这一预期。在图4中(一)小晶体聚焦良好，而大晶体略微散焦。在图4中(b条)记录时，样品沿光轴移动4µm，情况正好相反。到目前为止，显微照片上的散焦部分没有被过滤，因为在这些基本研究中使用的针孔仍然太大，无法提供焦点过滤效果。然而，焦点设置原则上是可行的。

图4 来自透射几何的AgTCNQ晶体的cSTXM显微照片（710 eV，120×120像素，30ms停留时间）。(一)位于菱形TCNQ晶体（白色圆圈）上的小AgTCNQ水晶聚焦良好，而左下角（黑色圆圈）的大AgTCNK水晶稍微散焦。(b条)样品沿光轴移动4µm，将大晶体移动到适当的焦点，而小晶体稍微散焦。

第一张显微照片已经揭示了未来cSTXM研究的一个重要问题。此外，停留时间是该样本合理STXM图像的10-15倍，计数率较低，因此图4中显微照片的信噪比（SNR）也较低(一)和4(b条)相对较差。这一发现并不奇怪，因为波带片的一阶衍射效率约为10%（Attwood，1999）). 因此，每增加一块波带片，设置的计数率就会减少至少十倍。然而，由于更好的背景抑制，较小的针孔的应用将大大提高成像质量。然而，辐照时间过长会增加梁诱导损伤的风险。辐射化学在软X射线显微术中已经进行了深入的研究，并且可以通过低温技术进行还原（Schneider，1998; Beetz&Jacobsen，2003年; 会见等人。, 2010; 斯帕斯等人。, 2014b条).

在离轴设置的荧光检测的情况下，低计数率的问题更加突出。我们无法以各自的共振能量对各种样品进行合理成像，包括基于磁性功能化PVA的微球（Brismar等人。, 2012)（710 eV，铁L（左）α-边缘）和铜矿床（935 eV，CuL（左）α-边缘）在Si上_三N个₄膜，即使在很长的光照时间。我们根据第二个波带片对探测器进行了二维扫描，像素停留时间为1s。发光样品是微球样品上非常致密的磁铁矿堆积物（Späth等人。, 2014一). 结果扫描（参见支持信息中的图S1¹)证明检测波带板后面存在荧光信号。另一方面，该信号极其微弱，几乎不超过背景噪声水平。

表1总结了我们离轴cSTXM装置光子效率的定量估算它表明，对整体效率的主要贡献并非来自荧光产额大约是10⁻²对于大多数常见金属L（左）-边缘，但来自相对较小的检测波带板覆盖的极小检测区域（立体角）。通用X射线荧光显微镜使用几个大面积探测器覆盖更大的立体角，从而检测尽可能多的光子（吉安诺切利等人。, 2013). 考虑到波带板直径为240µm，与样品的距离约为25 mm，波带板大约覆盖6×10的一部分⁻⁶样本周围的潜在可用球体。因此，装置的总光子效率为10⁻¹¹根据探测器类型。该估计不考虑样本处的自吸收，该自吸收可能对检测到的信号产生进一步的影响。考虑到微秒范围内合理记录时间的成像，即使是高通量波动光束线也可能无法在软X射线范围内提供足够的光子[～10¹³ 秒⁻¹（斯特罗科夫等人。, 2010; 山本等人。, 2014)]以获得足够质量和信噪比的荧光图像。

4.结论与展望

扫描共焦显微术的概念被用于通过扩展传统STXM和检测路径中的第二个FZP，实现软X射线领域的共焦成像。因此，可见光显微镜在以下方面的局限性横向分辨率可以被克服。我们提出了一种对准程序，以获得与照明点和探测针孔一致的第二个FZP的焦点。到目前为止，我们已经能够证明直线几何的概念证明；然而，理想的共焦成像几何结构只能通过显著较小的空间滤波器针孔来实现。由于我们使用第二个FZP作为放大元件，因此要求探测器针孔的直径小于1µm。这将提供共焦激光扫描显微镜所知的真实聚焦滤波和背景抑制成像。此外，与标准STXM相比，共焦装置的3D分辨率显著提高，因为我们检测到的共焦体积理想情况下由初始点扩散函数的平方确定。而横向分辨率只会受到轻微影响，我们预计普通高分辨率波带片的轴向分辨率限制在100nm以下。我们首次使用同轴几何学对cSTXM进行的实验结果证明了该技术对典型软X射线显微镜样品的适用性，以及确定所记录三维物体内不同焦平面的可能性。

对于离线几何中的cSTXM（也考虑真实共焦条件），图像质量在很大程度上取决于荧光光子的数量（背景上方）。理论估计和首次实验表明，安装在弯曲磁铁光束线上的装置的光子效率不足以提供合理的成像。考虑到未来通过使用较小的探测针孔进行改进，以及允许探测波带板非常接近样品的技术发展，我们仍然预计需要高亮度辐射源。与常见的大面积荧光检测器相比，波带板的极小检测面积是不可能补偿的。采用片上堆叠波带片的新方法显著提高了光学系统的光子效率（沃纳等人。, 2014); 然而，只有百分之几。

由于这些限制，进一步的研究将集中在内嵌cSTXM几何体上。使用最外层区域宽度较小的波带片可以缩短焦距，另外还有几个尺寸为100 nm的探测针孔，以及形状良好的3D标准样品，这些都将提供有关此设置的成像质量和分辨率限制的详细信息。此外，我们期望通过使用高阶成像技术，在所有三维空间和较低焦距（Rehbein等人。, 2009; 凯斯金波拉等人。, 2013). 对于当前分辨率最好的波带片的三阶成像，我们可以估计横向分辨率远低于10nm，轴向分辨率约为几十纳米。因此，我们期望cSTXM在未来高分辨率软X射线成像中发挥重要作用。