1.简介

绝大多数大分子结构由X射线晶体学确定，通常在原子水平上提供结构信息（Hendrickson，2000). 这些高分辨率结构模型的可用性是深入了解生物学基本过程、新治疗药物开发和新型纳米材料的基础（Matthews，1976; Blundell&Patel，2004年; Ikkala&Brinke，2002年). 由于难以结晶大分子复合物，如膜蛋白或分子机器，X射线晶体学很少是获取此类系统结构信息的技术选择。当前技术，例如电子显微镜，用于研究大分子络合物的方法是在非天然环境中获取络合物的结构信息，不允许研究与时间相关的大规模结构变化。小角度和广角X射线散射（SAXS/WAXS）等技术允许进行时间分辨研究，但其缺点是数据包含的信息量相对较低。在跟踪天然环境中大分子络合物的大规模结构变化的同时，增加溶液散射实验中信息含量的一种可能途径是波动X射线散射（fXS），这是Kam（Kam，1977）提出的一种方法; Kam公司等。, 1981). fXs实验是通过收集稀释散射体样品在低于粒子重新定向所需时间的曝光时间下的散射图案来进行的。可以表明，大量这些散射图案可用于估计单个粒子散射图案的平均环角自相关（RAC）（Kam，1977）; Kam公司等。, 1981; 萨尔丁等。, 2009, 2011). 虽然已经成功地在金纳米棒上进行了模型实验（Saldin等。, 2011)最终，人们希望将fXS技术应用于使用X射线自由电子激光研究大分子结构。由于有机材料的电子密度低，这些系统的散射强度本来就很弱，在大多数情况下，溶剂的存在会使散射强度恶化。为了从这些测量中获得任何有意义的结构信息，在处理数据时必须小心，例如背景减法。在结构重建方面，目前通过解决超相位问题来解决问题的方法在计算上仍然很难解决（Saldin等。, 2011). 在这里，我们提出了一种新的数据简化方法，可以普遍应用于fXS测量。此方法对于处理非均匀散射背景特别有用。此外，通过使用在实际空间中运行的反向蒙特卡罗型算法，可以直接确定实际空间结构。

2.实验

在氮化硅窗口上随机定向的镀铂金哑铃上进行了fXS测量。哑铃是从Sigma-Aldrich公司购买的100µg mL溶液⁻¹(https://www.sigmaaldrich.com/，零件号716936）。用去离子水稀释溶液，并将其旋铸到75 nm厚的氮化硅衬底上。如图1所示，所得样品在直径为15µm的点上平均有～20个哑铃(一).透射电子显微镜如图1所示，对研究中的样品进行了分辨率提高的（TEM）测量(b条)使用光子能量为545 eV的高相干X射线在高级光源的光束线9.0.1处收集X射线透射衍射图案。从单个样品上的不同点采集了100个衍射图案，每个衍射图案包含大约20个哑铃。每个衍射图案的散射强度由拍摄每个图像之前记录的入射光束强度归一化。

图1 (一)正在研究的样品放大部分的TEM图像。(b条)我们研究中使用的两个典型纳米颗粒的高分辨率TEM图像显示在44nm×83nm的矩形框中。

3.理论考虑

3.1. 实验数据分析

在上述实验条件下拍摄的典型X射线透射衍射图像如图所示。2如我们所见，由于fXS实验的两个固有要求，这种稀释系统的散射相对较弱：（i）不同粒子之间的散射干扰必须可以忽略不计；（ii）角起伏必须沿波矢传递相等的环保持倒易空间。这两个要求都要求光束中的粒子尽可能少，最终结果是散射强度较弱。这反过来又需要正确处理背景散射。鉴于波动散射实验旨在尽可能精确地获得散射体的平均环自相关，因此校正背景自相关中的系统误差至关重要。

图2 所研究样品的典型X射线衍射图。

我们开发的数据简化方法旨在解决这些问题。提出的程序和基本思想不仅限于二维系统，还可以用于三维fXS数据分析。我们首先将二维实验衍射数据转换为原点与直射光束位置一致的极坐标，并将所有测量强度表示为波矢传递函数，q个，以及极角，φ.总散射强度，，可分为两部分，一部分来自纳米粒子[信号，]另一种是考虑来自所有其他源的散射，例如来自衍射设置的衬底和固有背景[背景，],

我们继续将信号和背景强度分为两项，波动项和角度非各向同性项，和，以及每个值的平均值q个,我_萨克斯(q个)和我_公元前(q个)，所以

将其代入方程式（1)，一个获得

用衍射图案的平均强度减去衍射图案，我_萨克斯(q个)+我_公元前(q个)沿着每个衍射环，只剩下强度的波动部分，即,

由于背景强度来自探测器的电子噪声和非屏蔽辐射等源，因此它与仪器有关，在实验过程中不会发生变化。因此，可以假设背景的角度非各向同性部分，，不随图像变化。所有衍射图像上所有波动项的总和，N个，导致

由于粒子的散射强度随衍射图像的不同而波动，（6）中的第二项在大量衍射图像（大量N个),

根据方程（6）我们可以得到背景散射的起伏部分，

因此，可以使用以下表达式精确计算粒子的起伏散射，

哪里可以通过实验获得，如（5）所示). 一旦背景被移除，就可以获得RAC通过

哪里是沿着一个相等的环的角度划分的数量q个.

3.2. 结构建模

为了恢复纳米颗粒的真实空间结构，我们应用了反向蒙特卡罗（Metropolis等。, 1953)通过迭代比较计算出的二维环自相关数据和实验数据的类型方法。该方法首先构建真实空间模型，然后使用该模型模拟实验测量数据。在这里，我们为测量的纳米颗粒提出了一个圆柱形对称模型，原因有两个：第一，颗粒因生长而呈圆柱形，第二，颗粒随机地位于其侧面，颗粒的方向沿圆柱轴均匀。因此，我们的模型通过许多薄圆盘沿其对称轴以不同直径模拟纳米颗粒的形状。在这个模型中，圆柱的散射振幅可以使用玻恩近似法进行分析计算（Als-Nielsen&McMorrow，2001). 假设入射X射线束垂直于圆柱轴(年-轴），圆柱体的X射线散射振幅为

其中sinc(x个)=正弦(x个)/x个,ρ是电子密度，第页₀是汤姆逊散射长度，R（右）和H（H）分别是纳米棒的半径和长度，q个_第页和q个_年是垂直于和平行于圆柱轴的波矢传递分量，以及J型₁是第一类贝塞尔函数（McAlister&Grady，1998). 演示如何应用方程（11）计算柱对称粒子的X射线散射强度和RAC)我们以哑铃形金纳米粒子为例。该纳米颗粒的总长度为80 nm，中心圆柱的半径为12.5 nm，两端球的半径为15 nm。使用圆柱形薄片模型，可以通过将这种纳米颗粒沿其对称轴分成许多小薄片来计算其X射线散射模式，如图3所示(一)每个薄片可以近似为一个薄圆盘，其X射线散射振幅由（11）计算图3所示的此类粒子的总散射强度(b条)是所有圆柱切片的散射振幅之和的模平方，考虑到每个切片的位置相移。最后，可以根据图3所示的X射线散射图案计算RAC(c（c）).

图3 (一)哑铃的三维视图，沿着对称轴的切片代表模型中使用的圆柱体。哑铃的总长度为80 nm，中心圆柱的半径为12.5 nm，两端球的半径为15 nm。(b条)哑铃形金纳米粒子的X射线散射图(c（c）)RAC根据其衍射图案计算得出。（注意，X射线散射模式和RAC均以其自然对数绘制。）

4.结果和讨论

实验中获得的二维数据通过轮廓数据简化方法进行处理。由于实验装置的性质，存在明显的非均匀散射背景，，如图4所示(一)按照上一节所述的程序，从记录的衍射图案和起伏散射信号中有效地减去散射背景，从纳米颗粒中可以获得每个衍射图案。在我们的样品中，纳米粒子是围绕垂直于衬底的入射X射线束随机定向的，它们的分布和位置是如此的均匀，以至于粒子间的干涉可以忽略不计（Saldin等。, 2010). 由此产生的X射线衍射图样是单个纳米颗粒及其RAC、，由单粒子自相关和粒子间互相关两项组成。根据Kam（1977）)，大量由于纳米粒子的随机取向，将导致第二项抵消，并收敛到单个纳米粒子的RAC，,

哪里N个_{数据处理程序}是收集到的衍射图案总数N个_应用程序是每个衍射图案中的平均粒子数。图4所示的RAC(b条)是使用等式（10）计算的100个RAC的平均值)（平均约40个RAC后，模式开始收敛）。

图4 (一)实验非均匀散射背景。(b条)通过平均100个衍射图案的RAC获得的单个纳米颗粒的实验RAC。（两个数字均以其自然对数绘制。）

纳米颗粒的结构是通过沿着其对称轴将其分成80个1nm高的圆柱形切片来重建的。由于铂和金之间的低对比度，在我们的实验中无法检测到涂层的存在，并且在我们的模型中考虑了均匀的电子密度分布。假设纳米颗粒的中心对称性，我们只使用了40个独立的径向参数来优化函数，

哪里和是实验和计算的RAC。一种称为协方差矩阵适应进化策略（CMAES）的全局优化算法（Hansen&Ostermeier，2001）)用于确定最佳模型参数。我们从一个等半径的圆柱体开始拟合过程，CMAES算法迭代改变其值以最小化目标函数（13). 为了获得数值稳定的拟合结果，在目标函数中添加了对相邻圆柱半径的附加平滑约束。通常，整个装配和优化过程在台式计算机上几个小时内完成。模拟的RAC和纳米粒子结构的三维视图如图5所示.

图5 (一)模拟纳米颗粒的RAC（自然对数值）。(b条)根据实验RAC数据拟合得出的纳米颗粒结构的三维视图（所有轴均以nm为单位）。

根据图1所示的TEM测量(b条)我们注意到，我们样品中的纳米颗粒在纳米尺度上并不完全相同，但它们在长度和直径上的尺寸都非常相似。在这种情况下，我们通过拟合实验RAC获得的结构代表了样品中所有纳米粒子的统计平均值，而不是其中的任何一个。如图5所示(b条)，沿着对称轴有七个径向最大值，它们是在中心的一个和在两侧的三个，分别出现在距离中心18nm、24nm和33nm处，半径分别为15nm、14.7nm、17nm和12.7nm。距离两侧中心9nm处的两个明显最小值半径为7.2nm。结构中的所有这些特征可能反映了纳米粒子的一般生长偏好。虽然中央凸起不是结构建模中的伪影，但它可能由多种效果引起。除了生长过程中一些粒子携带的凸起（我们用TEM测量的50个粒子中，超过三分之一的粒子具有中间凸起）之外，正如在金纳米棒实验中观察到的那样，这也可能是由静止和不完整的粒子引起的（Saldin等。, 2011). 静止粒子沿X射线束的投影呈圆形，不完整部分主要是粒子的头部，这些粒子的头部也呈圆形。这两个因素都将导致结果结构中的中间凸起，以及来自增长的凸起。

最后，我们从方程（4）中注意到)小角度X射线散射（SAXS）强度，我_萨克斯与fXS实验同时进行。多年来，已经开发了物理模型和计算程序，以从SAXS实验数据中提取结构信息（Svergun，1999; 线路接口单元等。, 2012). 由于我们实验的性质，我们没有考虑平面外旋转，并且在结构建模中，定向平均被限制在二维。为了保持一致并使结果具有可比性，我们采用了与前一节中提出的相同的圆柱形切片模型来拟合我们实验中的SAXS数据。实验数据的拟合非常令人满意，如图6所示(一)结果结构模型如图6所示(b条)如图5中的结构所示(b条)和图6(b条)，它们在整体轮廓上非常一致，RAC配件的结构如预期的那样提供了更多细节（Kam，1977). 我们样品中的纳米颗粒不是单分散的，并且在微观上形状和密度不同，这一事实对SAXS和RAC数据有不同的影响，因此对其配件的结构也有不同的作用。对这种效应的完整解释涉及到从TEM等其他技术获得的纳米粒子电子密度分布的详细知识，目前正在进行中。然而，在一个简化的图片中，差异是因为SAXS强度始终为正，而RAC信号在零附近波动，并且电子密度变化的影响对SAXS信号累积，而对RAC信号则可以抵消。

图6 (一)实验和模型模拟的小角度X射线散射（SAXS）强度（以自然对数表示）绘制为波矢传递函数。(b条)根据实验SAXS数据拟合得到的纳米颗粒结构的三维视图（所有轴均以nm为单位）。

5.结论

总之，我们已经证明了使用波动X射线散射技术从颗粒在基底上的随机组装重建纳米级结构的能力。通过直接拟合从X射线衍射图样中获得的单粒子RAC和SAXS信号，用反向蒙特卡罗方法确定结构。尽管我们利用了纳米颗粒的柱对称性来简化拟合过程，但这种方法可以推广并用于结构测定 通过波动X射线散射，对结构本身的先验知识最少。这些简单实验的结果表明，随着真实空间建模技术和相关优化过程的进一步发展，基于真实空间的方法来确定溶液中粒子的结构在原则上是可行的。借助于强大的现代光源，例如X射线自由电子激光器，这种方法非常适合解决物质难以结晶的蛋白质结构。它不仅能够详细解析与蛋白质晶体学中获得的结构相当的结构，而且还提供了一种在天然环境下以时间分辨的方式研究它们的方法。