2.1. 晶体制备

嗜热蛋白晶体热蛋白分解芽孢杆菌（Sigma-Aldrich，目录号P1512）使用吊滴蒸汽扩散法生长（Hausrath&Matthews，2002）). 使用购买的蛋白质，无需进一步制备，并以100 mg ml溶解⁻¹45%(五/五)二甲基亚砜。将5µL该蛋白溶液与5µL35%混合制成滴剂(五/五)DMSO，设置超过5%(五/五)饱和硫酸铵。晶体空间组 P（P）6₁22几天后就长出来了。大约在数据收集前1天，将晶体转移到含有30%的坐液中(五/五)乙二醇置于30%乙二醇的良好溶液中。用30%的乙二醇在几个小时内清洗晶体几次，以消除任何残留的二甲基亚砜。

2.2。X射线数据采集和处理

在束线ID14-EH4（McCarthy）收集X射线数据等。, 2009)在欧洲同步辐射设施。孔径设置为产生一个矩形光束横截面40微米（水平）×100微米（垂直）。能量设定为13.20 keV（0.9393 Au）。使用单晶（一根250µm长的六角棒，直径100µm，沿其长度具有均匀的视觉外观）进行数据采集。在每个温度下，以10%的透射率收集四组数据(即在与晶体相互作用之前，光束强度衰减了90%。在由50帧（1°振荡，每帧曝光时间1s）组成的数据集中，使用程序计算吸收0.25 MGy的剂量放射性核素（派哈扎尔等。, 2009). 在数据集之间，晶体在相同的总振荡范围内暴露，但透射率为100%(即射线未衰减），对应于～2 MGy的剂量。在100 K下暴露后，温度以0.1 K s的速率升高⁻¹至160K时，晶体平移80µm，留下40µm未暴露的晶体材料间隙；然后重复这个过程。40µm间隙的目的是限制100 K暴露期间产生的有害物质扩散到用于160 K暴露的晶体区域。在100 K时，半影辐射损伤仅限于直接暴露于X射线束的区域周围的几微米（Holton，2009). 由于实验是在160 K下进行的，因此认为可能需要一个远大于几个微米的间隙。在160 K下收集数据后，温度升高至240 K，晶体再次平移80µm。然而，在240 K下，散射图案没有显示出布拉格衍射斑点。温度由牛津Cryosystems 700系统控制，升温速率为0.1 K s⁻¹.MOSFLM公司（莱斯利，1992年)和SCALA公司（埃文斯，2006年)用于处理所有数据，分辨率为2.2º，第四个数据的分辨率极限为160 K。截断用来确定威尔逊B类-因子（French&Wilson，1978)和电子秤（豪厄尔和史密斯，1992年)确定相对各向同性B类-数据集之间的因子。

通过计算总衍射强度来确定强度衰减(我_总数)对于来自〈的数据集我〉和作为输出的反射总数SCALA公司（表1; 使用34到2.2℃的所有数据），并将其归一化为每个温度下的第一组数据。一个情节我_总数 与剂量产额D类_1/2，剂量我_总数下降了1/2（欧文等。, 2006). 这个B类-通过计算B类-每个温度下相对于第一组数据的系数(B类_相对)使用电子秤线性拟合的斜率B类_相对 与 D类得出灵敏度系数，（克梅特科等。, 2006).

2.3. 结构精炼和分析

对于结构测定和精细化，刚性体精炼首先在蛋白质数据库（PDB）条目8tln上对第一个100K数据集（以下称为数据集100一)使用REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 1997). 受限位置和B类-因子精炼随后使用所有数据（预留5%以下R（右）-免费计算），交替进行地图检查、模型构建以及水的去除和添加使用库特（埃姆斯利等。, 2010). 这种改进的100K结构（结构100一)然后用作初始模型精炼与上述七个其他数据集进行比较。坐标已保存在PDB中，并带有登录代码3便士7便士,第7页,第7页,第37页,3p7吨,3p7单位,3p7伏和3p7瓦.

结构分析采用EDPDB公司（张和马修斯，1995年),库特,UCSF奇美拉（佩特森等。, 2004),MSMS（座椅位置记忆系统）（桑纳等。, 1996)和作者之一（DHJ）编写的程序。EDPDB公司用于计算B类-要素变化、坐标操作和结构叠加。库特,加州大学旧金山分校Chimera和PyMOL公司（Schrödinger，San Diego，CA）用于结构可视化和映射原子属性(例如 ΔB类和d日_数控)以协调位置。毫秒用于计算溶剂可及表面积和分子体积。每个原子到最近溶剂通道的距离(d日_数控)决定如下。首先晶胞被划分为间距为1°的三维矩形网格。根据截止距离（4.5º）将网格点指定给“溶剂通道”：如果网格点大于每个蛋白质原子的截止距离，则将其指定给“溶液通道”。其次，计算了感兴趣原子和所有溶剂通道网格点之间的距离。最小的此类距离被指定为参数d日_数控对于那个原子。当前工作的基本结果是，精炼原子的变化B类-因素，ΔB类，由于辐射暴露与d日_数控在160 K时，对该截止距离是稳健的，值在3到6°之间，给出了相同的定性结果。相关系数使用StatPlus公司和Microsoft擅长.

将我们的结果与先前报道的辐射损伤实验进行了比较。使用的结构是嗜热蛋白（PDB代码3打1/3打0)，乙酰胆碱酯酶(1个/1个)，苹果酸脱氢酶(2j5公里/第二季第五季)和人醛糖还原酶(3小时/3条大腿)100 K和乙酰胆碱酯酶(2vja型/2vjb型和2vjc公司/2vjd公司)在100和150K下。

3.1. 全球指标

全球指标（总衍射强度，威尔逊B类-因子、镶嵌性和单位细胞体积）提供了在160K下与100K相比辐射损伤增加的证据（表1和图1). 提出了两种辐射灵敏度的全球度量方法，一种基于衍射强度(D类_1/2=晶体总衍射功率减少1/2时的剂量；欧文等。, 2006)另一个基于B类-剂量系数（Kmetko等。, 2006). 这里，在100 K时我们发现D类_1/2=14 MGy和秒_AD公司= 0.033 Ų MGy公司⁻¹在160 K时，我们发现D类_1/2=8.5 MGy和秒_AD公司= 0.060 Ų MGy公司⁻¹.

图1 归一化平均强度（上限）和B类-因子（较低）与剂量有关。线连接连续的点。

在所研究的两个温度下，镶嵌性都随着剂量的增加而增加（图2). 单位细胞体积和蛋白质体积也随着剂量的增加而增加，在两种温度下的增长率大致相同（图2). 然而，在160 K时，单位细胞体积的增加是各向异性的：一个细胞边缘(一)增加，而另一个(c（c）)减少（表1).

图2 镶嵌性（上部）、单位细胞和分子体积（下部）对剂量的依赖性。线连接连续的点。马赛克值来自MOSFLM公司。分子体积使用MSMS（座椅位置记忆系统）.

3.2. 特定辐射损伤

特异性辐射损伤最初是用差分傅立叶图进行研究的，该图显示了通常预计会显示特异性损伤的部位的一些最大易感性。例如，在前十名中F类_o个^100b条-F类_o个^100一峰值（5至8σ; 来自精细100a结构的相位），其中两个发生在S_δ结构中的两个蛋氨酸和五个蛋氨酸的原子位于羧酸O原子（四个天冬氨酸和羧基末端）。此外，四种钙离子和活性中心锌离子在F类_o个^100b条-F类_o个^100一地图。

由于非同构，160K系列以及100K系列和160K系列之间的傅里叶差分图不太容易解释（表1). 许多最强的地图特征都与原子位置的移动有关。因此，我们转向精细结构来评估X射线照射的影响。

图3通过比较辐射暴露对精炼的B类-整体因素B类-因素变化。在100 K下，比较数据集时，通过此测量得出的最敏感残留物一和b条Met、Asp、Glu和Lys按降序排列（图3). 请注意，嗜热菌蛋白酶中没有半胱氨酸，因此也没有二硫键。在160 K时，这些残留物仍然敏感，但其他残留物表现出类似的敏感性（按以下降序排列B类-比较数据集时因素随暴露的变化一和b条：赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺）。金属位置在100 K时的敏感性高于平均值。在160 K时，锌具有大约平均敏感性，而钙离子变得比平均值更敏感。

图3 ΔB类在100 K（上部）和160 K（下部）时，按残渣类型。正值表明，平均而言，残留物经历的B类-与结构的其他部分相比，辐射暴露导致的因子增加。在160 K数据集绘图中b条——一色氨酸的值（−2.2º2)偏离了刻度。

4.1. 全球损害指标

嗜热菌素晶体在100 K和160 K下都对辐射敏感。使用强度衰减(D类_1/2)或B类-因子衰减(秒_AD公司)100K时的灵敏度是100K时脱铁蛋白灵敏度的两到三倍（欧文等。, 2006; 克梅特科等。, 2006). 此外，无论使用哪种测量方法，嗜热菌素晶体在100 K到160 K之间的辐射敏感性大约增加了一倍，这与胰岛素晶体的增加相似（Meents等。, 2010)，葡萄糖异构酶（博莱克等。, 2007)和thaumatin（Warkentin&Thorne，2010）)在相同的温度范围内。

我们还检查了单位细胞体积和镶嵌变化。细胞体积和蛋白质体积都显示出对辐射暴露的类似反应：7 MGy的膨胀率为0.4–0.5%，这在两种温度下也是相似的（图2). 这与仅对温度变化的反应形成对比，温度变化时细胞体积膨胀约为蛋白质体积的三倍(即比较数据集100一和160一). 已经讨论了温差响应，它与包括晶体（蛋白质与本体溶剂；Juers&Matthews，2001年; 克里姆斯基等。2002年).

辐射诱导的单位细胞体积膨胀的原因一直存在一些争议（拉维利等。2002年; 会见等。, 2010; Warkentin&Thorne，2010年). 最近有人提出，分子氢气的生产通过脂肪基团的X射线照射使晶胞（会见等。, 2010). 此处观察到的细胞和蛋白质体积膨胀的大小与剂量的函数相似，这表明(一)在电池的两个区域以相同浓度生产氢气，或(b条)氢气均匀快速扩散晶胞生产后。尽管在由30%组成的散装溶剂中有脂肪族(五/五)乙二醇]，它们在蛋白质中的浓度应该更高。因此，这里倾向于采用快速扩散模型。然而，Warkentin&Thorne注意到H的扩散₂气体在100K下通过无定形冰的速度可能很慢(即～100 s，移动～25个水分子；Warkentin&Thorne，2010年).

4.2. 损伤特异性：OH自由基与160和100 K时的电子

以前对100 K下蛋白质晶体的观察表明，辐射敏感部位包括二硫键、羧酸基、酪氨酸羟基和蛋氨酸碳硫键（Weik等。2000年; Ravelli&McSweeney，2000年; Burmeister，2000年). 热溶蛋白晶体的行为类似，蛋氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基在100 K时表现出最高的辐射敏感性。注意，热溶蛋白中没有半胱氨酸残基。

与蛋白质晶体有关的自由基反应的详细机制主要是用模型化合物的电子自旋共振（ESR）研究的，但现在也在用单晶分光光度法（Carpentier）研究等。, 2010). 在最基本的层面上，X射线辐射通过从原子中射出电子而造成损伤通过光电效应或康普顿散射（主要损伤；von Sonntag，1987; 索斯沃思-戴维斯等。, 2007). 这些高能电子随后会导致进一步电离（二次损伤）。参与二次损伤过程的可能物种包括电子和空穴，以及在晶体的蛋白质和溶剂区域产生的其他自由基。后者产生的自由基包括来自水的自由基（溶剂化电子和水电子，和

在77K时，蛋白质中的电子似乎是可移动的，一直移动到被电子阱捕获为止（琼斯等。1987年)例如二硫键（Symons，1995)或者，在没有它们的情况下电子亲和力。然而，在多肽键长距离迁移之前，孔洞会被捕获通过酰胺质子的损失（Symons，1995). 电子和空穴，以及初级损伤事件，可能是在100 K下观察到的特定辐射损伤的原因，这在之前已经讨论过（Ravelli&McSweeney，2000; Burmeister，2000年). 例如，二硫化物断裂被认为会发生通过 电子捕获，而酸性侧链的脱羧作用被认为是从初级事件或钻孔转移。100 K下的某些事件可能由其他物种触发，例如蛋氨酸可能导致硫醚损失通过氢原子俘获（岛津等。, 1964).

在160 K下，辐照的嗜热蛋白晶体与100 K下的晶体具有不同的特性。晶体中约98%的蛋白质原子在160 K时比100 K时对辐射更敏感。而蛋氨酸硫和羧酸O原子仍然比平均值更敏感，其他位置(例如赖氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸，见图3)表现出同等或更高的灵敏度。因此，损伤的特异性似乎在100到160K之间发生了一些变化。这种新的损伤特异性的一个可能来源是在晶体的溶剂区域产生的OH自由基。

在77 K下，水性聚环氧乙烷的ESR光谱在几天内保持稳定，包括来自OH自由基的信号，这些信号在升温到115 K时消失（Zakurdaeva等。, 2005). 其他实验表明，在90–130 K（Kroh）范围内，冰中辐射诱导的OH自由基消失等。, 1961; 扎库尔达耶娃等。, 2005; 普隆卡等。, 1984). 在各种低温ESR实验（Boon等。, 1984). 其他观察结果表明，H自由基在115 K以上移动（Fisher&Devlin，1995; 索斯沃思-戴维斯等。, 2007; Garman&Nave，2009年). 因此，我们可以预计，将嗜热菌素晶体的温度提高到160 K将显著增加OH和H自由基的损伤活性。

羟基自由基是强大的氧化剂，负责各种氨基酸修饰（Xu&Chance，2007）; Davies&Dean，1997年)，包括删除(例如酸性侧链的脱羧），以及在随后的反应中，向氢原子抽象形成的自由基中心添加其他部分。此外，羟基本身可以添加到芳香环和硫中心。这里，我们衡量辐射损伤的标准是原子量的增加B类-因素，这显然会对删除事件敏感。增加事件发生的可能性较小B类-因子增加，除非，例如，它们导致更大的构象紊乱。

有几个已知的过程涉及OH自由基，与我们在160 K下的结果一致。通常，这些是多步骤过程，首先涉及在侧链某处创建自由基通过与…反应随后，这个侧链自由基与分子氧发生反应，在某些情况下，不稳定产物的分解(例如Arg、His、Cys；Xu和Chance，2007年). 由于其疏水性，分子氧应存在于晶体的蛋白质部分中。这些氧化反应导致精氨酸导致胍基丢失（Ayala&Cutler，1996）; 徐等。, 2003)天冬氨酸和谷氨酸的脱羧（戴维斯等。, 1995; Xu&Chance，2004年)，脯氨酸残基处的主链断裂（Dean等。, 1989; 内田等。, 1990)蛋氨酸中硫醚的损失（希勒等。, 1981; Xu&Chance，2007年)，赖氨酸对侧链伯胺的损失（Hawkins&Davies，2001; Davies&Dean，1997年)以及乙酰胺（天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的模型化合物）的分解酰胺类；莱特纳等。2002年). 这些都是在较高温度下可能变得更加活跃的可能反应，解释了160℃时辐射敏感性的改变与100 K。

OH自由基还间接负责与大多数氨基酸的加成反应（见上文），导致侧链上许多不同位置的羟基化或羰基化（Xu&Chance，2007）). 如果一个羟基化事件被定向到晶体中每个蛋白质分子的特定侧链上的同一位置，我们期望它在差异图中显示为正峰。然而，地图检查没有显示出这样的峰，表明如果发生这种加成反应，则占用率低。加成反应可能会受到蛋白质基质中空间位阻的抑制，特别是因为残基对羟基化最敏感(例如Tyr和Phe）是这些蛋白质中埋藏最深的。据我们所知，目前关于蛋白质X射线晶体学中辐射损伤的文献并不包含电子密度图中辐射诱导增加的证据。

4.3. 残余深度在辐射损伤防护中的作用

先前的研究表明，原子的溶剂可及表面与其在100K下的辐射敏感性之间没有相关性（图4)（拉维利和麦克斯威尼，2000年; Burmeister，2000年; 菲奥拉万蒂等。, 2007). 相关但不同的参数对辐射敏感性的影响尚未解决，即原子到蛋白质和溶剂之间最近的界面的距离（以下称为深度）。由于我们对晶体蛋白质的深度感兴趣，我们确定了原子到最近溶剂通道的距离(d日_数控)而不是分离到蛋白质表面。然后我们考虑了原子的剂量依赖性之间的相关性ΔB类和d日_数控作为测量辐射灵敏度与晶体溶剂的接近程度的依赖性。

图4 具有130个最大原子的嗜热蛋白分子的主干道B类-因子随球体增加而增加（对应于蛋白质中约5%的原子；氧=红色，氮=蓝色，碳=小麦，硫=黄色，钙=青色）。在100 K（上部；显示了分子的两个正交视图）时，130最大B类-因子增加均匀分布在整个分子中，包括两个蛋氨酸Sδ原子（黄色）。相反，在160 K（较低）时，它们偏向表面，包括表面暴露的钙离子（青色）。使用准备的图PYMOL公司。

图5(一)显示ΔB类 与 d日_数控对于结构中的所有原子。线性拟合斜率表明ΔB类在d日_数控首次曝光时，160 K时比100 K时大10倍（−0.31与−0.03º，表1). 对于第二次和第三次曝光，160 K的斜率分别为-0.19和-0.12º，100 K的斜度分别为-0.06和-0.03º。因此，这种影响持续存在，但随着曝光时间的延长，效果就不那么显著了。

图5 的依赖项ΔB类在溶剂通道附近进行首次辐射照射。(一)的绘图ΔB类 与d相比数控对于100 K（顶部）和160 K（底部）结构中的每个原子。数据的线性拟合为黑色。对于100 K图ΔB类和d日数控为−0.13，线性拟合的斜率为−0.03º。在160 K时，相关性和斜率分别变为−0.44和−0.31º。(b条)ΔB类 与d相比数控平均每个残渣类型。在100 K（顶部）和160 K（底部）之间ΔB类和d日数控显著改善，从−0.23到−0.81（不包括蛋氨酸）。

的坡度ΔB类 与d相比_数控对嗜热菌蛋白酶与先前发表的辐射损伤研究进行了比较。在增加的剂量下，PDB中有几组精细的蛋白质结构，大多数在100K下。在一种情况下，给出了在100K暴露前后的两种嗜热菌蛋白酶结构，尽管工作的细节尚未公布，并且在相应的PDB条目中没有给出剂量信息(3打1/3打0). 的坡度ΔB类与d日_数控对于这对结构，其值为−0.09 Au，与我们的100 K值−0.03 Au类似。其他100K结构，即乙酰胆碱酯酶（Weik，Ravelli等。, 2001; PDB代码2vja型/2vjb型)苹果酸脱氢酶（Fioravanti等。, 2007; PDB代码2j5公里/第二季第五季)和人醛糖还原酶（Petrova等。, 2009; PDB代码3小时/3条大腿)对于1、3.3和2.0 MGy的剂量，分别给出−0.09、−0.12和−0.19Ω的斜率。只有一种情况下，乙酰胆碱酯酶在100 K和更高温度下都有数据。在这种情况下ΔB类 与d相比_数控在100 K（剂量=7.0 MGy）时为-0.10 Au，在150 K（剂量=6.5 MGy）下为-0.26 Au，与本文报道的实验温度范围相似，增加了2.6倍，其顺序与我们的结果相同，如下所示。使用类似的剂量，我们计算了100 K（100）时−0.12 Au的斜率d日 与100一; 在160 K（160d日 与160一，剂量为7.1 MGy），变化率增加5倍。

ΔB类 与 d日_数控按残留物考虑。图5(b条)显示的图形ΔB类 与d相比_数控对于每种残基类型，在晶体中的所有原子上取平均值。不包括蛋氨酸，160 K时的相关性（相关系数=−0.80）远大于100 K时的相关系数（相关系数=−0.23）。（注意，因为较深的残留物显示较小ΔB类，之间的相关系数ΔB类和d日_数控为负值。）总之，数据表明，平均而言，残留物与溶剂通道的接近程度可以预测ΔB类160 K，但不是100 K。

一种解释负相关性的方法ΔB类具有d日_数控在160 K而不是100 K时，晶体溶剂区产生的OH自由基不再被捕获，而是自由扩散并造成损坏。它们接触到的第一个残留物应该是溶剂通道中的那些残留物，因此深埋在蛋白质内部的残留物比靠近表面的残留品受到的损害要小。坡度ΔB类具有d日_数控随着连续暴露而接近于零，这表明这种依赖于深度的保护在剂量较大时会变得不那么有效。也就是说，先前接触造成的损坏会削弱外部残留物的保护作用。

在100 K时，锌和钙离子的磁化率均大于平均磁化率。在160K下，锌原子的磁化率几乎没有变化，而钙离子的磁化率则显著增加。锌离子由两个组氨酸和一个谷氨酸连接；组氨酸往往比其他残留物受到更少的辐射损伤，因为它们与锌结合，可能会为该离子提供一些保护。组氨酸和锌-丙氨酰-组氨酸复合物（锌肌肽）都是已知的羟基自由基清除剂（Chan等。, 1994; 吉川等。, 1991). 因此，这种活性中心金属可能会自然地受到OH自由基损伤的保护。另一方面，钙离子都是由羧酸盐、羰基或水的O原子连接而成的，而已知这些基团容易受到损伤。对钙配体的损伤可能会从蛋白质中释放钙，这一事件更可能发生在溶剂流动性更大的情况下，溶剂流动性可能存在于160 K（见下文），因为钙必须释放到散装溶剂中。

4.4。溶剂流动性和旋转静态障碍

两者之间的负相关ΔB类和d日_数控也可以简单地解释通过在160K下产生更大的静态无序，而不是由于在100~160K温度下释放的OH自由基促进的依赖深度的损伤。辐射照射引起的衍射降解必须涉及相邻分子的逐渐错位。随机平移偏差会导致B类-在所有原子上均匀的因子。随机旋转错位将导致B类-因子在离平均旋转中心更远的原子中增加。在160 K时，这可能更为相关，因为更大的溶剂流动性可以更容易地进行此类移动。坡度ΔB类 相对于d_数控160 K时约为-0.3°。假设嗜热菌蛋白酶的平均半径为～25º，这意味着表面的原子显示ΔB类约7.5Ų大于中心原子，对应于0.1º²原子均方位移(使用). 这相当于辐射暴露后的角紊乱比之前大约0.012 rad或0.7°。坡度的减小ΔB类 与d相比_数控如果连续暴露，则表明随着暴露的继续，旋转失调对静态紊乱的影响较小。

晶体的溶剂部分表明，在160 K时具有更大的流动性。在160 K下，电池体积的各向异性发生变化（图1)，表明在晶胞160 K时（另见表1)这需要大量溶剂分子重新分布。此外，在160 K，而不是100 K时，可以看到粉末衍射环，这表明立方冰的形成，这意味着至少一些散装溶剂已经通过玻璃化转变（威克、克里格等。, 2001; Juers&Matthews，2004年; 基姆等。, 2009). 用于160 K测量的晶体区域的镶嵌性显示出显著改善，这表明初始冷却过程产生了一些应变，随着温度升高到160 K，应变得到缓解，并且产生的数据集质量略高于100 K时的数据集（然而，我们不能排除这样的可能性，即晶体的这一区域的内在镶嵌性比用于100K测量的晶体区域低。）这种更大的溶剂流动性可能促进自由基物种（包括新获得的基于溶剂的自由基）降解晶体接触而引发的旋转无序的形成。

此时，上述两种模型都无法消除。这两个过程都可能发生。可以使用高分辨率数据来区分它们，以允许同时进行精炼入住率和B类-因素，因为旋转无序模型会影响B类-除溶剂生成自由基模型外，其他因素主要影响占用率。另一种可能是在辐射暴露后进行质谱分析，以确定损坏事件的位置和类型。