X-ray contact microscopy system for spectromicroscopy of biological specimens

Ito, A.; Shinohara, K.; Mizukami, Y.; Nakano, H.; Yada, K.; Uehara, T.; Honda, T.

doi:10.1107/S0909049597018931

短通信

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同步加速器
辐射

国际标准编号：1600-5775

第5卷| 第3部分| 1998年5月| 第1099-1101页

https://doi.org/10.107/S0909049597018931

用于生物样品光谱显微镜的X射线接触显微镜系统

伊藤忠寿,^一 ^* Kunio Shinohara公司,^b条水井裕隆,^c（c）中野久子,^d日 Keiji Yada公司,^{e（电子）} Takayuki Uehara公司 ^c（c）和本田俊雄 ^c（c）

^一日本神奈川县平冢市北名1117号东海大学工程学院核工程系259-12，^b条日本东京大学医学院放射研究所，邮编：113，^c（c）千叶大学工程学院图像科学系，1-33 Yayoi-cho，Inage-ku，Chiba-shi，Chipa 263，Japan，^d日日本东京都医学院放射研究部，地址：日本东京113区文桥区本科马贡3-18-22号^{e（电子）}青森公立学院，153-4 Yamazaki，Goshizawa，青森030，日本
^*通信电子邮件：aeito@keyaki.cc.u-tokai.ac.jp

(收到日期：1997年8月4日； 1997年12月8日接受)

开发了一种基于X射线吸收特性的X射线接触显微镜系统，用于研究生物样品中的分子和元素分布。该系统包括一个用于测量生物分子XANES（X射线吸收近边缘结构）的腔室，以及一个用于使用电子变焦管干燥样品的接触显微镜系统。利用该系统，研究了HeLa细胞中碳、氮、氧、钙和铁的元素分布，并利用DNA的XANES谱图中的一个峰，获得了DNA相关图像K-得到了磷的吸收边。

关键词：光谱显微镜;XANES公司;元素分析;哺乳动物细胞.

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1.简介

X射线显微镜最专业的应用之一是利用软X射线区域的特定吸收特性绘制生物细胞中元素和分子的图谱。利用XANES峰的光谱显微镜L（左）-对含有钙的生物样品尝试了钙的吸收边；例如Kenny等人。（1985年 )首次拍摄到人类颅骨中的钙。稍后，巴克利等人。(1993 )股骨头部切片中软骨细胞区域的精细磷酸钙沉积。他们讨论了使用Ca箔（Buckley）的XANES剖面形成图像的定量方面等人。, 1994 ; 巴克利，1995年 ). 巴克利对钙的化学状态差异进行了成像等人。(1994)针对骨中钙羟基磷灰石和假体中磷酸三钙的不同分布。巴克利等人。(1995 )还比较了与骨关节炎相关的一些钙盐的XANES谱。阿德等人。(1992 )，张紧随其后等人。(1994 )，应用XANES峰值K-利用DNA中C=C键的光谱与牛血清白蛋白中的光谱的差异，将碳边缘定位到染色体中DNA的分子图谱。利用接触显微镜系统和电子变焦管作为检测器，我们获得了HeLa细胞胞内区域在覆盖生物样品中主要元素吸收边缘的宽波长范围内的吸收光谱（Shinohara等人。, 1994 ; 伊藤等人。, 1996 )，并尝试使用XANES峰值在细胞中进行DNA成像K-磷的边缘（Shinohara等人。, 1997 ).

在本研究中，我们扩展了我们的系统，使其包含一个用于测量分离生物分子XANES谱的腔室，这使我们能够在分子成像之前更准确地测定XANES峰。此外，新开发了一个用于分析细胞中元素的计算机程序，并提供了改进的图像。

2.材料和方法

2.1. 实验布局

图1显示了X射线接触显微镜系统的光学布局。该系统由两个串联对齐的部分组成，用于生物样品薄膜的光谱分析，然后是干燥样品的接触显微镜。从BL-12A获得单色X射线，覆盖K-碳、氮和氧的边缘，以及L（左）-铁和钙的边缘，从BL-11B覆盖K-磷和硫的边缘，在日本筑波材料结构科学研究所光子工厂。能量分辨率(E类/ΔE类)BL-12A约为100，BL-11B约为1500-2500。使用硅光电二极管探测器（AXUV-100，美国国际辐射探测器公司）测定生物分子XANES中共振峰的能量后，将样品和探测器从光路中移除。然后，可以在相同波长和相同光路下对干燥的生物标本进行成像。

图1
X射线接触显微镜系统的布局，包括光谱部分和带有电子变焦管的接触显微镜（成像部分）。

2.2. XANES测量

从小牛胸腺（Sigma Chemical Co.，USA）和半胱氨酸（Wako Pure Chemical Industries Ltd，Japan）中提取的DNA在一个由EM-grid支持的火棉胶膜上制备成干薄膜K-磷和硫的边缘。

2.3. 接触式成像

其他地方已经描述了使用电子变焦管的接触显微镜，该电子变焦管布置在用户友好的系统中用于处理样本（Shinohara等人。, 1997; 伊藤等人。, 1997 ). 将培养在SiN膜上的人HeLa细胞用戊二醛固定，然后干燥。为了观察有丝分裂细胞，用0.25µg ml处理8小时，细胞分裂周期停止⁻¹诺卡唑溶液。

2.4。元素分析

为了获得主要元素C、N、O、Ca和Fe在细胞内的分布，在吸收边缘每个元素的。波长被采用，因此它们位于XANES区域之外，并由Henke列出等人。(1993 )他将元素的光学数据制成表格。透射率(我/我₀)通过除以光子强度得到每个像素中图像的(我)在每个像素中我₀，单元格外部区域的平均值。以下是两者之间的关系光密度表示为A类_j个（=对数我₀/我)和元素的含量（质量厚度）我表示为ρ_我x个，其中ρ_我和x个分别为密度和试样厚度，

$[A_j\equiv-\log T（\lambda_j）=\sum_{i=1}^n\mu_i（\lampda_j）\rho_ix.\eqno（1）]$

在方程式中，λ_j个和n个分别表示波长和元素数量：T型(λ_j个)和μ_我(λ_j个)表示透射率和质量吸收系数元素的我波长λ_j个分别是。ρ_我x个可以通过减法得到A类_j个从A类_j个′在两侧(λ_j个和λ_j个′)的吸收边缘元素的我在质量吸收系数的近似下，μ，除我在两个波长上都相等。然而，当λ_j个和λ_j个′距离不近。在我们之前的论文中（Shinohara等人。, 1994)碳含量（在某些情况下为氮和氧）被认为是其他元素映射的校正值。应用最小二乘法将是一种更好的方法，特别是在绘制钙和铁等微量元素的地图时。要获得最小值 $[\sum_{j=1}^m（A_j^*-A_j）^2]$ ，其中米是波长数和A类_j个^*是一个实验值，应求解以下法方程，

$[\cases{\mu_{11}\rho_1x+\mu_}12}\rho2x+\mu_{13}\rho_3x+\，.，.，.\，+\mu_1n}\rhonx=B_1\cr\mu_21}\rho _1x+\ mu_{22}\rhe_2x+\mu_{23}\rhu3x+\$

哪里

$[\mu_{pq}=\sum_{j=1}^m\mu_p（\lambda_j）\mu_q（\lampda_j）\quad\quad（p，q=1\rightarrow n），]$

$[B_p=\sum_{j=1}^m\mu_p（\lambda_j）A_j\quad\quad（p，q=1\rightarrow n）。]$

这些程序的计算机程序已经开发完成。

2.5. 分子分布

分子XANES峰波长处的图像与峰下的图像之间的比值图像显示了生物细胞中的分子分布。

3.结果和讨论

3.1. 有丝分裂HeLa细胞中DNA-相关P和蛋白相关S的分子成像

在图2中(一)在K-磷的边缘。半胱氨酸在K-硫磺边缘（图2b条). 峰值图像之间的比率图像（图3一)峰值以下（图3b条)DNA的XANES图谱如图3所示(c（c）). 细胞中央部分的DNA相关分子的某些结构清晰，这与图3所示的硫图像形成对比(d日). 染色体结构的鉴定需要进一步的分辨率和灵敏度。

图2
XANES配置文件(一)DNA在K-磷的边缘，以及(b条)半胱氨酸K-硫的边缘。

图3
有丝分裂HeLa细胞中DNA和半胱氨酸相关分子的比率图像。(一)图像位于A类在面板中(一)图2的

; (b条)图像位于B类在面板中(一)图2的

; (c（c）)比率图像(一)和(b条); (d日)半胱氨酸相关分子的比率图像，使用图2的XANES剖面

(b条).

3.2. 间期HeLa细胞的元素成像

图4显示了C、N、O、Ca和Fe的图像。它们是从波长1.76、1.83、2.16、2.36、2.79、3.16、3.45、3.65、3.98和4.48 nm处观察到的图像中获得的，并使用最小二乘法进行计算。碳、氮、氧在核区的密度分布；密度较大的区域可能对应于核仁。在核区似乎仍能观察到钙，但铁的图像基本上很模糊。将其他元素考虑在内并将其纳入计算，将提高图像的保真度。

图4
通过最小二乘法获得HeLa电池中的元素分布。(一)3.45 nm下的图像(b条)碳(c（c）)氮气(d日)氧气(e（电子）)钙(（f）)铁。

总之，本系统成功地利用XANES剖面的吸收峰成像，并利用最小二乘法通过计算机程序解释元素分布。正在进一步改进化学分析的分辨率和灵敏度。

鸣谢

我们感谢北岛义弘博士和小林胜美博士在光子工厂BL-11B和BL-12A系统设置方面的专业知识，感谢森泽隆先生帮助进行元素分析，感谢迈克尔·福德雷先生帮助学习英语。这项工作得到了光子工厂咨询委员会的批准（提案编号93-G319、95-G283和95-G284），并得到了教育、科学、体育和文化部科学研究拨款（a）的部分支持。

参考文献

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